著者は彼らの専門的な技術支援のためにシェリー謝とジェニファーペインに感謝します。この作業は小児泌尿器科とスタンフォード小児研究基金協会からの助成金を戴いています。

尿道カテーテルのI.準備<ol><li>各マウスの膀胱及びサンプリングする腎臓の場合は、それぞれ1クライオバイアルチューブ5-6ステンレススチール製ビーズ（膀胱、1.6 mmのサイズまたは0.9〜2.0ミリメートルのブレンド）または酸化ジルコニウムビーズ（腎臓、0.5mmのサイズ）を配置。ビーズを含むチューブをオートクレーブ。 </li><li>周囲温度に冷却管の後、各ステンレススチールビーズを含むチューブと各酸化ジルコニウムビーズを含むチューブに滅菌PBS 400マイクロリットルに滅菌PBSの200マイクロリットルを追加。 </li><li>ハングアップしたとHultgren 13で説明したように我々は、尿道カテーテルを準備。フラットヘッド鉗子と細かいハサミ（虹彩または類似の型）のきれいなペアをオートクレーブと楽器が周囲温度まで冷却することができます。 70％エタノールで層流フードの表面を拭いてください。フードでは、ポリエチレンチューブの30cm（おおよその）セグメントをカット。無菌的に滅菌3 ccシリンジに滅菌30ゲージの針（1 / 2インチ長い針）を置きます。オートクレーブ滅菌ピンセットでカットポリエチレンチューブの一端をピックアップし、それがハブを満たすまで、針の上にチューブをスライドさせます。約2cmの針の先端を超えるようにチューブをカット。滅菌ペトリ皿の中で注射器と場所からカテーテルを削除します。 </li><li>交差汚染の可能性を低減するため、我々は、それぞれのマウスで、もう1つカテーテルを行います。すべてのカテーテルが行われた後、少なくとも30分間UV照射するために、カバーペトリ皿の中での曝露によって、それらを滅菌する。 UVランプを直接見たり、ランプが活性化されている間フードで体のどの部分を公開しないでください。 UV露光後、カテーテルをシャーレでの長期保存することができます。私たちは、無菌性を維持するためにパラフィルムで皿を密封することをお勧めします。 </li></ol> II。動物接種<ol><li>マウスは、ストレス誘発性の交絡因子を避けるために実験的操作の前に少なくとも週に到着してください。雄マウスの尿道はカテーテルを挿入することは極めて困難であるため、雌マウスが使用されます。 CBA / Jは一般的に利用、UTI -感受性の近交系マウス系統です。これは老化の前に免疫学的成熟度のウィンドウであるため、マウスは、生​​後8〜12週間の間に使用する必要があります。実験の初日に、凍結した細菌株のバイアルに滅菌白金耳の端を浸し。適切な寒天プレートに小さな接種とストリークを集める。一般的に、尿路病原性E.大腸菌 （UPEC）と他の株は37℃ルリア-ベルターニ（LB）寒天培地上で一晩成長させることができる·周囲空気中のC。 UPECの菌株は、LB寒天培地上に固体、黄色がかった白色半透明のコロニーとして成長する。すぐに冷凍庫に細菌株を返します。尿路病原性細菌株は繰り返し、シリアル文化との時間をかけて弱毒になることができます。したがって、我々は、各実験のための新鮮な寒天プレートをストリーキングをお勧めします。 </li><li>実験の2日目に、適切なコロニー形態を確認した後、一夜ブロス培養物の少なくとも5 ccで寒天プレートと場所から単一のコロニーを選択。 LBブロスは、ほとんどの尿路病原性菌株（37℃、周囲空気中で200 rpm）に使用することができます。通気を可能にするためにブロス培養管にキャップが緩んでおいてください。 </li><li>実験の3日目に、I型線毛の発現を増強するために、（通常37℃、200rpm）し、再び一晩培養液の最初のブロス培養物および培養の10％を取る。 I型線毛は、 生体 1 の uropathogensのための重要な病原因子であることが示されているので、シリアルブロス培養は、細菌のuropathogenicityを最適化するのに役立ちます。通気を可能にするためにブロス培養管にキャップが緩んでおいてください。 </li><li>実験の4日目に、3日目からブロス培養物のOD 600を測定する 。既にテストされている菌株については知られていない場合、OD 600とCFUの関係を決定するために少なくとも7ログ（PBSで行わ希釈、LB寒天上で実行される文化を、37℃インキュベーション一晩）を介して十倍希釈系列のメッキを行う/ mlの。経験則として、0.4から0.5のOD 600は、一般的に50マイクロリットルあたり1 × 10 7 CFUに対応しています。 OD 600とcfu / mlの間の関係が決定されると、1つはPBSの50マイクロリットルのマウスあたり希望のCFUに対応するOD 600ブロス培養物を調整することができます。いくつかの作品は、むしろ50より10マイクロリットルの接種は、kidneys6に少ない逆流につながることを示唆している。しかし、ほとんどの出版物は、マウス当たり50マイクロリットルを使用することを報告している。一般に、10 6および108 CFU /マウス間のCFUの範囲を望ましいが、それぞれの細菌/マウス系統の組み合わせは経験的に生体内でテストする必要があります。 </li><li>その接種を確保するために、注入後すぐには無効とされていない、マウスは全身麻酔の導入前に少なくとも30分間水を奪われるはず。別のキー操作は、マウスをscruffingことによって、麻酔導入前にボイド誘導ゆっくりと下abdomを押すのです。バス。イソフルラン2〜2.5％が1.8から2パーセントイソフルランとメンテナンスの麻酔が続く8月12日週齢の雌のCBAマウスのための安全な誘導の用量、である。 </li><li>麻酔が達成されると、マウスは、イソフルラン含有酸素に接続されているノーズコーンに挿入された彼らの頭と仰臥位に配置されます。下腹部は膀胱から尿を排出するマッサージ。膀胱は比較的空の場合、この操作は、尿が得られないことがあります。下腹部や会陰部を70％エタノールに浸漬される。 </li><li>針のない滅菌1 ccシリンジは、所望の細菌の接種を策定するために使用されます。次に、滅菌尿道カテーテルは、無菌的にシリンジに配置されます。チューブのわずか1〜2ミリの針の先端に遠位残るように余分なチューブは、ハサミでカテーテルを切断される。その後、注射器が盗聴されており、プランジャーは、すべての気泡を除去するために直立シリンジで落ち込んで。静菌性潤滑ゼリーをほんの少し加えたは、滅菌ペトリ皿または無菌の注射器のラッパーの内部に噴出される。カテーテルの先端は、（添付シリンジ）ゼリーに浸漬する。複数の菌株が同一の実験でテストされている場合、別の菌株を含むカテーテルを潤滑するためにゼリーの同じドロップを使用しないように注意してください。 </li><li>倍率のステレオ顕微鏡（5倍ズームの範囲に0.8倍）を使用して、麻酔マウスの陰​​核包皮を穏やかに微歯ピンセットで非利き手で把握されており、深いピンクの尿道口を（公開する頭側に引き上げ図1）。注射器は、（添付カテーテル付き）鉛筆のグリップを利き手で把握されており、カテーテルの先端を45度の角度で尿道口に従事している。陰核包皮が注射器の長軸に沿って引き伸ばされ、効果的にカテーテルに尿道を&quot;ロード&quot;。マウスの尿道が冗長であるため、この操作は必須です。カテーテルは膀胱（最大ハブに、図2）に簡単にスライドするはず、とそっと尿道の冗長なひだを移動するためにくるくるすることができます。カテーテルが減衰します。つまりされたらそれはマウスの長軸と平行になるまで、注射器を下げることができる。非利き手では利き手のようなカテーテルと注射器の位置を安定させるために鉗子をドロップすることができますゆっくり接種（少なくとも5秒）をインジェクトするために使用されます。流体が注入時にカテーテルの周囲に流れて見られる場合は、膀胱のどちらかがフルになる、またはカテーテルは、膣（尿道にちょうど尾側）になります。注射はすぐに停止し、カテーテルの位置は慎重に検討する必要があります。カテーテルが尿道にあった場合、与えられたマウスは、実験には含まれるべきではない。一方、膣に見当違いのカテーテルを再配置することができますし、注入は、再試行。注入後、カテーテルと注射器をゆっくりとマウスから引き出される。 </li><li>投与細菌を避難させると、それによって変数の感染レベルにつながる可能性のある早期の接種後の排尿、の可能性を減らすために、いくつかの研究者は、経尿道的inoculation10後30分間麻酔下でマウスを維持する。手術後、マウスは正常な呼吸パターンと活動のリターンを確認するために、連続観測でクリーンな地球温暖化の毛布の上に回復する必要があります。かつて動物が完全にクロールするための能力を回復した、それらは寝具含有ケージに戻されることがあります。 </li></ol> III。感染組織における測定CFU <ol><li>様々なマウスUTIの出版物は、6時間から1週間以上、接種後に培養結果に報告されている。最適な時点は、各細菌/マウス系統の組み合わせのために実験的に決定する必要があります。排せつされた尿は無菌のペトリ皿の上にマウスをscruffingによって培養のために取得されます。採取した尿は常に氷上で保存する。マウスの排尿は、頻繁に（ボイドあたり30から100マイクロリットル）音量が低い、とストレスに依存するので、多くの時間で排せつされた尿を得るために複数の試みは、必要な場合があります。 </li><li>排せつされた尿検体を得た後、私たちはイソフルランと頚椎脱臼を使用してマウスを生け贄に捧げる。腹部を無菌的に開かれます。排せつされた尿検体が正常に以前取得されなかった場合、少量の尿が頻繁に30ゲージの注射針と注射器を使用して膀胱の壁を通って吸引することができます。 </li><li>一方または両方の腎臓を取り出し、滅菌ペトリ皿上に少なくとも4個（各部分が50マイクログラム未満でなければなりません）にミンチ、そして氷の上でジルコニウムビーズ/ PBS含有cryovialsに配置されます。膀胱は、削除、少なくとも4個に細切し、およびステンレス鋼のビード/氷上でPBS含有cryovialsに配置されます。組織/ビーズ/ PBS含有cryovialsは、ブレットブレンダー、ホモジナイザーに配置され、組織が1分間&quot;8&quot;速度設定を使用してホモジナイズしている。一部の組織片が均質化した後に残されることが一般的です。液体ホモジネートの50〜100マイクロリットルをピペッティングすることができる限り、固体の断片必ずしも問題ではありません。均質化の時間が一部のサンプルの増加させると、それは均質化の一貫性を維持するために、すべての組織のためにそうすることが重要です。それは、交差汚染の可能性を回避するため、我々はブレットブレンダー、ホモジナイザーを使用、個々のサンプルの標準ホモジナイザーを使用して1つずつ処理するよりも迅速である、と大幅に均質化されているサンプルを加熱していません。 </li><li>採取した尿および組織ホモジネートの少なくとも二、三十倍希釈液をマイクロタイタープレートで行う必要があります。予備実験のためにそれは、少なくとも7つの十倍希釈を行うことが賢明であろう。尿、膀胱、および/または適切な寒天で腎臓のホモジネートを100マイクロリットルの文化まで。尿検体は、ボリューム制限の可能性があるので、それは10倍希釈を行う前に100マイクロリットルにそれらのボリュームを持ってする必要があるかもしれません。これが必要な場合は、最初の希釈は、（十倍希釈前）細菌の収量の最終的な計算に分解する必要があります。これらのメディアは、グラム陰性菌に対して選択的であるため、我々は、エオシンメチレンブルーやマッコンキー寒天培地（37℃で一晩インキュベートC）で培養UPECを好む。 UPEC株は乳糖を発酵する能力のために集中的に臍窩、赤ピンクコロニーとしてマッコンキー寒天培地で成長する。 </li><li>一晩培養後、各プレートのためのCFUをカウント。希釈したサンプルについては、50から100コロニーを含むプレートの希釈は、最も正確な数とみなされます。 &quot;戻る&quot;組織ごと、組織のミリグラム当たり、または1mlあたりCFUを算出する。 </li></ol> IV。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。鉗子で頭側に陰核包皮を持ち上げて露出尿道口（濃いピンク組織）（写真の上を越えて） <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。尿道をカテーテルを挿入。二分クリトリスはちょうどカテーテル上に見ることができます。 <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。膀胱CFUは2日間尿路病原性大腸菌を8週齢の雌のCBA / Jマウスの経尿道感染後のカウント大腸菌 。膀胱はマッコンキー寒天培地上で連続希釈メッキして均質化し、CFU / mlを決定した。ダイヤモンドは、水平のバーが中央値CFU / mlを示し、個々のマウスについてはCFU / mlを示している。

<ol>
	<li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice.">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li><li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract.">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li><li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli.">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li><li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract.">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li><li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies.">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li><li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. 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利害の衝突は宣言されません。

細菌の経尿道的接種によるマウス尿路感染症の誘導は、老舗が技術的な要求手順11です。ハングとHultgrenは最近、マウス尿路感染症13の経尿道的技術の優れたレビューを発表した。本稿では、さらにこの実験的なアプローチの細かい点を説明しよう。 初心者は、膀胱を公開する正中開腹術を行うインドインク（PBS中の1％）の希釈溶液を注入し、膀胱の青色...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cryovial tubes, 2.0 ml polypropylene (no caps)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>640201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps for cryovial tubes, with 'O' ring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>E&amp;K Scientific</td>
<td>440011-N</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bullet Blender</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Next Advance</td>
<td>BBX24</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zirconium Oxide Beads (0.5mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>ZROB05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Beads (1.6mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stainless Steel Bead Blend (0.9-2.0mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Next Advance</td>
<td>SSB14B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CBA/J Mice, 8-12 week old female</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Laboratories</td>
<td>000656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate Buffered Saline (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na2HPO4 4.3mM, KH2PO4 1.4mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>1.10285.0500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isoflurane (Aerrane)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>NDC 10019-773-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculating loops</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-363-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eosin-methylene blue (EMB) agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Himedia Laboratories</td>
<td>MM022-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MacConkey agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212123</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB agar powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intramedic non-radiopaque polyethylene tubing, PE10 [inner dimension 0.28 mm (0.011 inch); outer dimension 0.61 mm (0.024 inch)]</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>427401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>30 gauge needles, 1/2 inch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>305106</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml tuberculin Slip-Tip syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3 ml Luer-Lock syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>309585</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transurethral induction of mouse urinary tract infection

興味の尿路病原性菌株は、寒天上で増殖されています。一般的に、尿路疾患<em&gt; E.大腸菌</em&gt;（UPEC）と他の株は37℃ルリア - ベルターニ（LB）寒天培地上で一晩成長させることができる·周囲空気中のC。 UPECの菌株は、LB寒天培地上で黄色がかった白色半透明のコロニーとして成長する。適切なコロニー形態の確認後、シングルコロニーを培養液で培養されるに応じて選択されます。 LBブロスは、ほとんどの尿路病原性菌株に使用することができます。二つのシリアル、一晩LBブロス培養物はI型線毛、尿路病原性の細菌のための明確に定義された毒性因子の発現を増強するために用いることができる。ブロス培養物（PBS）リン酸緩衝生理食塩水で所望の濃度に希釈されています。 8〜12週齢の雌マウスは、イソフルラン麻酔下に置き、経尿道的にポリエチレンチューブで覆われた30ゲージのシリンジを使用して細菌を接種されています。経験的にそれぞれの細菌/マウス系統の組み合わせのために決定しなければならない典型的な接種は、10です。<sup&gt; 6</sup&gt; 10〜<sup&gt; 8</sup&gt; CFU PBSの10〜50マイクロリットルのマウスあたり。希望の感染期間（数週間に一日）、尿サンプルと膀胱と両方の腎臓が収穫された後。各臓器は、細かく刻むPBSに入れ、そしてブルーブレットホモジナイザーで均質化する。尿および組織ホモジネートが直列にPBSで希釈し、適切な寒天上で培養されています。翌日は、コロニー形成単位がカウントされます。

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Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

このビデオでは、経尿道的にマウスの尿路感染症を誘発し、結果として感染症の程度を定量化する方法を紹介します。

マウス尿路感染症の経尿道的誘導

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.5K ビュー.  Stanford University. このビデオでは、経尿道的にマウスの尿路感染症を誘発し、結果として感染症の程度を定量化する方法を紹介します。

ビデオ: Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

実験的自己免疫性下垂体炎の誘導のためのマウス下垂体免疫原の調製

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

免疫・感染学

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

SJLマウスにおける実験的自己免疫性下垂体炎の誘導

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, which accurately reflect disease establishment and progression, permit dissection of host-pathogen interactions and generation of immunity to infection. In mice, intravesical instillation of uropathogenic E. coli, the causative agent in more than 85% of community acquired UTI, recapitulates many of the stages of infection observed in humans. Until recently, however, UTI could only be modeled in female animals. This limitation has hindered the study of sex-related differences in UTI, as well as other bladder pathologies, such as cancer. Here, we describe a method to instill male mice that allows direct comparison between female and male animals and provide a detailed protocol to assess bladder tissue by flow cytometry as a means to better understand host responses to infection. Together, these approaches will aid in the identification of host factors that contribute to sex biases observed in UTI and other bladder-associated diseases.

The established model of transurethral catheterization of mice allows the study of bladder pathologies, including urinary tract infection, but can only be performed in females. A new model of male transurethral instillation, presented here, will enable research in an area marked by strong clinical and epidemiological differences between the sexes.

小動物モデルにおける尿路感染症: 雌雄マウスの尿道カテーテル

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Transurethral Instillation Procedure in Adult Male Mouse

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into the urinary bladder to either induce animal models of bladder pathologies or evaluate the effectiveness of intravesical treatments. Most rodent models of lower urinary tract (LUT) pathologies are induced in female mice due to ease of intravesical instillation of the substances via the female urethra. However, due to anatomical differences between the female and male LUT, transurethral instillation in a male mouse has been deemed a very challenging procedure, and it has not been previously described. In this manuscript, we provide a detailed description of how to prepare polyethylene (PE) tubing for subsequent insertion into the urethra of a male mouse. In addition, we discuss the ideal types of PE tubing to be used depending on the desired site of inoculation. Furthermore, we describe point by point how to prepare an animal for a successful transurethral instillation to avoid injury to the urethra and ensure the delivery of the solution to the desired location. The procedure is started by retracting the prepuce and the glans to expose the opening of the urethral meatus. Next, the glans are grasped by blunt non-crushing forceps to stabilize the penis and the PE tubing. The PE tubing is first inserted into the urethral meatus parallel to the animal body, then its angle is adjusted by tilting the catheter to maneuver it to follow the natural curvature of the urethra. This technique can be used to induced murine models of bladder pathologies and/or evaluate the effectiveness of intravesical treatments in male mice.

Transurethral instillation is a challenging procedure and has not been well described in the literature. The aim of this manuscript is to describe a technique for transurethral insertion of a catheter for intravesical delivery of liquids with active substances into the urinary bladder and/or prostate in adult male mice.

大人の雄のマウスに経尿道的注入手順

Transurethral instillation can be used to deliver different solutions with active ingredients (e.g., drugs, chemicals, bacteria, and viruses) locally into ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

ヘリコバクター ・ ピロリ感染と胃の病理のマウス ・ モデル

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

下流の単一細胞分析のため尿路感染症のマウスモデルから生成された単一細胞内細菌群集の分離

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

ブレオマイシンの気管内注射によるマウス肺損傷の誘導

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...