この方法は、精子の質の化学的確定などの精子生理学の分野で重要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、サンプルを品質で大量に分離する能力と、代替方法と比較した場合の適応性です。この方法は、精子の質の違いに関する洞察を提供することができますが、混合細胞タイプや異なる密度を持つ細胞内成分などの他のサンプルにも適用できます。
まず、2つの別々のチューブに2つの3ミリリットルパーコール希釈液を作ります。きれいな試験管で、2ミリリットルのPBSで1ミリリットルの精液サンプルを希釈する。そっとパイプで溶液を混ぜます。
滅菌の円錐管に低密度パーコールソリルションの3ミリリットルを加えます。次いで、より低密度のパーコール溶液の下に3ミリリットルの高密度パーコール溶液を慎重にピペット化する。45度の角度で円錐管を傾けながら、パーコール密度勾配の上に希釈精液サンプルのピペット3ミリリットル。
ブランクチューブを調製した後、20分間1500 Gsで両方のチューブを遠心分離する。遠心分離後に、3つの異なる層の精液が浴槽に形成されていることを確認します。ピペットを使用すると、最上層から始まり、中央層で始まり、チューブの下部にある硬質ペレットで終わる3層の精液を収集します。
各層を無菌マイクロ遠心管に移します。1.5ミリリットルのPBSで各精液サンプルを希釈し、サンプルを1500 Gsで1500 Gsで遠心分離します。最後に、上清を注ぎ、運動バッファーでペレットを再構成します。
このプロトコルでは、パーコール密度勾配遠心分離技術(PDGC)を用いて、精液サンプルを3つの異なる層に分離した。精子は、高密度溶液より下の高品質の層、高密度溶液と低密度溶液の中間品質層、および低密度溶液の上の低品質層に分離する。精子の質のこれらの違いは、生存率の違いによって証明されます, 移動性, 浸透性.
この手順を試みる際には、サンプルを室温にする必要があることを覚えておくことが重要です。PDGCの成功は、勾配の慎重な準備だけでなく、分離された層の慎重な収集に依存しています。開発後、この技術は、鳥類種の生殖能力のバイオマーカーを探求するために精子ペルディオミクスの分野での研究への道を開きました。
