この研究は、RGMにSLBとU54HD068157にNIHの助成金GM055360によってサポートされていました。 JMBはペンシルバニア大学（GM008216）でT32遺伝学研修助成金によって支えられている。

STA-PUTプロトコルは、3つの段階を含む：1）全体の精巣から細胞懸濁液の装置および試薬、2）準備、3）セルの負荷、沈降、およびフラクションコレクションのセットアップします。 2人の研究者のチームによって行われた場合に、プロトコルは、平均して8時間かかります。 1。 STA-PUT装置を設定します（図1） *** STA-PUT装置は、4℃、大規模な冷蔵庫やコレクションの方法を優先する場合にも、フラクションコレクターを収容することができ、低温室に配置する必要があります。 <ol><li>前（あるいは、少なくとも数時間前）には、メソッドを実行する夜は、すべての機器（特に、ガラス製品、チューブ）を洗って、70％エタノールで滅菌する。完全に、図1に示すような装置を組み立てる前に、機器を乾燥させる。 </li><li> （二L 2シリンダ（ 図 1BおよびC）および細胞装填室を確保<strオング&gt;図1A）トップのプラットフォームへとチューブクランプでチューブの2小片ですべてを接続してください。クランプすべての管が閉鎖した。右端の2Lのシリンダーに注ぎ口をシール。 </li><li>細胞装填室の小さな撹拌棒（ 図1A）、2％BSAを含むことになる左端の2 Lのシリンダ内のより大きな撹拌棒（ 図1B）を配置します。 </li><li>プラットフォーム（ 図1D）に2リットルの沈殿槽を配置します。沈殿槽（ 図1D）の下部の開口部の上に直接金属バッフル（ 図1F）を配置します。バッフルはフラクションコレクションの間の細胞勾配の液体と混乱のボルテックスを防ぐため、これは非常に重要です。沈殿槽の上にふたをする。 </li><li>三方活栓（ 図1G）のすりガラスジョイントに真空グリースを微量塗布した後、それ自体の底部にストップコックをクランプストップコックおよび沈降室のすりガラス継手を接続するdimentationチャンバ。 </li><li>チューブと活栓の右アウトレットに細胞装填室（ 図1A）を接続します。ストップコックを閉じます。 </li><li>活栓の左アウトレットに細胞分画チューブを取り付けます。分画チューブは開放端に接続されたガラスパスツールピペットを用いてチューブの一部を含む。小さなボアチューブ片をガラスピペットの狭い方の端に取り付けられている。狭いピペットは、フラクション回収時の細胞懸濁液の流れを制限する。一番下に、この小さなチューブをクランプする。 </li><li> 2 Lクレブスを準備（1X）の実験（ 表1）の日をバッファリング。その後、1Xクレブス、1Xクレブス中550ミリリットルの4％BSA、および1Xクレブス中の50ミリリットル、0.5％BSA中550ミリリットルの2％BSAを準備します。濾過し、4℃にこれらのソリューションを冷却</li><li>右L 2シリンダ（ 図1C）及び2％のBSA中の4％BSA溶液を注ぐ左2Lのシリンダ（ 図1B）内の溶液。必ずこれらのシリンダをつなぐチューブに大きな気泡がないことを確認。 </li><li>セル負荷室にKrebs緩衝を注ぎ、沈殿槽で、このチャンバーを接続する配管を埋め、これらは勾配を乱す可能性があるので、確認して大きな気泡が存在しないこと。優しくチューブを絞るか、フリックすると、気泡を除去するのに役立ちます。クレブス緩衝液のすべてがチューブ内ではなく、セル室にあることを確認します。 </li><li>クレブス緩衝液に少量の沈殿槽に流入した後、チューブを充填し、任​​意の大きな気泡を除去するために細胞分画チューブにほぼすべてのバッファを流出させる。 </li><li>直接沈殿槽の下にフラクションコレクターを配置します。すべての端数管が適切に配置され、汚染を防止するために、プラスチック製のラップで覆いいることを確認してください。 </li></ol> 2。全精巣から造精細胞を単離する<oL&gt; <li>あらゆる汚染物質を洗い流すために、室温でクレブス緩衝液中のCA 12成体マウス（好ましくは、少なくとも8週齢）および場所から精巣を解剖。例示されてこのプロトコルは、実験用マウスの使用を必要とするし、ペンシルベニア大学の制度的動物実験委員会のガイドラインに従って実行されました。 </li><li>あなたは精細管を追加する予定直前コニカルチューブ内の50ミリリットルKrebs緩衝液に45 mgのコラゲナーゼを追加します。このソリューションは、数分間33℃まで加熱することができます。 2 50ミリリットルコニカルチューブに均等に分割します。 </li><li>白膜を破棄し、精細管を解放し、8ミリリットルクレブス緩衝液を含有する別のプレートに精巣をカプセル解除。白膜は、精細管を包囲する薄い膜である。細管は容易に白膜からデタッチする必要があります。これを行うには、白膜の切開を行い、PAIでこの膜を開催鉗子のR、および鉗子の別のペアでから離れて膜から細管を押してください。 </li><li>コラゲナーゼ溶液25mlを含む各コニカルチューブに細管を含む4ミリリットルクレブス緩衝液を加え、10分間33℃で振とう、インキュベートする。最後には、細管は「スパゲッ​​ティ状」の外観を持っている必要があります。 </li><li>細管は、チューブの底に約5分間沈降することができます。上澄みを注ぐと細管をチューブの底に毎回沈降させ、（室温）25ミリリットルKrebs緩衝液で2倍を洗う。各チューブの中で〜5ミリリットルクレブス緩衝液を残す。 </li><li>洗いながら、あなたは精細管を追加する予定直前ファルコンチューブに50ミリリットルKrebs緩衝液に30mgのトリプシンを追加します。このソリューションは、数分間33℃まで加熱することができます。 2 50ミリリットルコニカルチューブに均等に分割します。 </li><li> 25ミリリットル細管を含む2チューブの各々にトリプシン溶液を加える。セルを防ぐために、各チューブに3μgのDNA分解酵素（1μg/10ml）を追加凝集からのS。 10分間33℃で、揺れ、インキュベートする。 </li><li>約10倍とアウトそれらをペッティング、細管を含む溶液を撹拌するワイドボアピペットを使用してください。ソリューションは、複数の単一細胞懸濁液のように見えるを開始する必要があります。 </li><li>さらに10分間33℃で、揺れ、インキュベートする。約25倍に出入りしてピペッティング、単一細胞懸濁液中に細管を分散させるために広い口径のピペットを使用してください。それでも細管あるいは細胞塊がたくさん表示された場合は、ピペットを用いてより多くの分散および/または、各チューブへの別の3100μgのDNA分解酵素（二重初期濃度）を追加します。 </li><li> 100μmのメッシュセルストレーナー（30ml mlの細胞懸濁液を各チューブに1つ）を介して単一細胞懸濁液をろ過する。細胞懸濁液を結合し、細胞の総数を（7-8×10 8個の細胞の間にあるべきである）カウントされます。 ***勾配上に以上800,000,000細胞をロードしないでください。 </li><li>ステップ2.10で得られた細胞数に基づいて、approprをペレットiate 5分間450 RCFでフィルタ処理する細胞の体積と30ミリリットルクレブス緩衝液で洗浄する。繰り返します。 ***通常22精巣は、複数の800,000,000の細胞が得られますが、この細胞の数を超えてセットしないでください。 </li><li>丁寧に泡立てない（細胞凝集の程度に応じて）DNA分解酵素μgの2.5〜5を含む25ミリリットルの0.5％BSAで細胞を懸濁します。細胞が凝集しないことを確認してください。 100μmのメッシュセルストレーナーを通して単一細胞懸濁液をろ過する。セルは現在、ロードする準備ができました。チューブを数回転倒ロードする前に、よく混ぜる。 </li></ol> 3。セル負荷および沈降<ol><li>必ずストップコックが閉じているが、液体沈降室（ 図1D）中に細胞チャンバ（ 図1A）から流れることを可能にする位置で行った。 </li><li>ゆっくりと攪拌棒が連続的に移動できるように設定を低（約70回転）の両方撹拌棒板を回しますが、。 </li><li>細胞チャンバ（ 図1A）内に細胞懸濁液を注ぎ、細胞を、10ml /分（ 図1D）のレートで堆積チャンバ内に徐々に流入するようにストップコックを開く。ストップコックを閉じます。流量は、堆積チャンバのボリュームの間隔をマークすることによって決定することができる。 </li><li>細胞チャンバ内に0.5％BSA溶液5mlを注ぎ、10ml /分の速度で沈殿槽に排出。ストップコックを閉じます。この工程は、細胞チャンバから細胞を洗浄します。 4Xを繰り返します。 </li><li>勾配を準備します。セル室（ 図1A）と2 2Lのボンベ（ 図1BとC）の間にクランプを開き、40ミリリットル/分の速度（ 図1D）で沈殿槽に液体を排出するために始めるすぐに。それが沈降室に、BSA勾配をロードするのに約20〜30分かかりますので、流量を調整します。の上に横たわっている細胞の薄い、乱されていない層BSAの勾配が表示されるはずです。 BSAのほとんどがロードされると、ストップコックを閉じ、液体は分別管内に沈殿槽から排出することを可能にする位置に回します。 </li><li>撹拌プレートをオフにします。 </li><li>細胞は1時間45分間沈降することができます。この時間の間に装置を乱すことがありません。任意の機械的攪拌は、グラデーションを乱す可能性があります。 </li></ol> 4。画分の分別と分析あなたは、次の手順を実行し、***、勾配を乱さないように注意してください。 BSA勾配が乱れている場合は、手順が動作しません！ <ol><li>細胞が沈殿した後、徐々に50ミリリットルコニカルチューブに沈殿槽から50ミリリットルを排出し、脇に置きます。この画分は、通常の細胞と破片の不要な塊が含まれています。 </li><li>フラクションコレクターに端数チューブを取り付けます。 ***フラクションコレならば手作業でフラクションを収集することも可能であるctorのは使用できません。 </li><li>画分を収集します。（1コレクションチューブに充填する）10ミリリットル毎45秒を収集されるように、ストップコックで流量を調整します。 </li><li>フラクションコレクションチューブに蓋をし、4℃で450 RCFで5分間スピン、そっと上澄みを捨て、残りの液体中に細胞を再懸濁し、氷上で細胞を維持する。 </li><li>すべての画分が収集されると、微視的に異なる細胞集団のための画分を分析する。異なる細胞型は、細胞サイズおよび核の形態8,15に基づいて区別することができる。 図2（a）は体細胞および減数分裂細胞および精原細胞について富化された3つのプールされた画分を、（b）は、円形精子細胞のための「代表的な結果」を示し、 （C）精子細胞を伸長と凝縮。 <ul><li>精原細胞を入力して12-14μmのCAのです。直径とクロマチン組成が均質で丸い核を持っている。 </li><li> B型精原8-9μmのCAのです。直径とrounている核周辺部に沿ってより密度の高いヘテロクロマチンを示してD核。 </li><li>前細糸期の精母細胞は7.5-8.2μmのCAです。直径、タイプB精原細胞より小さい細胞質を持っており、B型精原細胞と同様に見える核を持っている。 </li><li>細糸期精母細胞は、8月10日100μMのCAです。直径と事前細糸期の精母細胞と同様に見えますが、核膜でより密なクロマチンを得るように見える核を持っている。 </li><li>接合期精母細胞は、10月12日100μMのCAです。直径と細糸期精母細胞と同様に見える核を持っている。 </li><li>パキテン期の精母細胞は、任意の場所に12〜18ミクロンのCAからである。直径と大きな核を取り巻く細胞質の細いリムで構成されています。密なクロマチンのより多くの塊が核内で見ることができます。 </li><li>丸い精子細胞は、10μmCAです。直径と中央の密集染色染色中心と丸い核を持っている。 </li><li>残余体は直径〜6.5μmであり、円形で、核を欠いている。 </li><li>伸長と凝縮精子細胞は、精子細胞を丸める大きさが似ていますが、ユニークな、鎌形核を持っている。 </li></ul><ol><li>分15で始まり、85までのすべての5画分を分析。通常、15以下の画分をすぎて混合し、塊状となり、85以上の画分を、使用可能な細胞にいくつか含まれています。 </li><li>割合を分析するには、（細胞を遠心分離した後再懸濁されたら）画のコレクションチューブから液体5μlのを取り、クレブス緩衝液は8％ホルムアルデヒド5μlのに追加。固定した細胞は、5分間室温で静置する。 </li><li>固定した細胞を0.1％トリトンおよびDAPI（5μ/ mlのクレブス緩衝液）5μlのを追加します。細胞を、5分間室温で静置する。 </li><li> 、スライド上に得られた溶液を10μlを置きカバーガラスでカバーし、各画分の純度を決定するために、蛍光顕微鏡で分析します。 </li><li>減数分裂と体二倍体細胞、円形精子および伸長/凝縮する精子細胞：大きさや核の形態が類似している細胞の次の集団を作成する（「代表的な結果」を参照）の分画を結合します。 </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleoprotein+transitions+during+spermiogenesis+in+mice+with+transition+nuclear+protein+Tnp1+and+Tnp2+mutations.">Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations.</a> Biol. Reprod. 71, 1016-1025 (2004).</li><li>Manku, G., Mazer, M., Culty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+testicular+gonocytes+isolation+and+processing+for+immunocytochemical+analysis.">Neonatal testicular gonocytes isolation and processing for immunocytochemical analysis.</a> Methods Mol. Biol. 825, 17-29 (2012).</li><li>Dehnugara, T., Dhar, S., Rao, M. 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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。例示されてこのプロトコルは、実験用マウスの使用を含む、すべての関連するガイドライン、規制、規制当局に準拠して実行されました。このプロトコルで使用される動物は、ペンシルベニア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUCプロトコル番号804284）の指導と承認の下で維持されている。

信頼性の高い細胞培養系は、まだすべての精子形成細胞タイプ3を生成するために存在していないとして、精子形成を研究者たちは、精子形成細胞サンプルのための動物モデルに依存しています。精子形成細胞が容易に全体の精巣から収集しているが、唯一の混合集団をもたらす。これは、減数分裂細胞、円形精子、と凝縮精子細胞など、これらの細胞の特定のサブタイプを、勉強し?...

哺乳類の精子形成は精巣1の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。簡単に言うと、精細管の格差の上皮の近くに存在する精原細胞のような幹、その後減数分裂を起こす精母細胞に分化。減数分裂が完了した後、得られた半数体細胞、または円形精子細胞は、精子、細胞質及び核の圧縮の脱落を伴う分化プロセスを受ける。精子細胞は徐々に、それぞれ、鞭毛を開発し、核の伸びや、結露を起こし、伸長してから凝縮する精子細胞を生成する。最終製品は、精細管の内腔に放出され、最終的に、彼らは、さらに成熟精巣上体にしている精子、です。 精子形成のプロセスは、特殊なホルモンや分子の状態に依存しているため精巣は、精子形成の全過程のための信頼できるインビトロ培養系は、まだ2,3開発されていない。培養方法は、幹細胞から「始原生殖細胞様細胞」および半数体、「円形精子細胞様細胞」を作成するために開発されてきたが、これらの方法はまだ、これらの細胞を大量に生成し、それ以降の精子形成細胞を生成するために失敗することができない種類4,5。幸いなことに、精子細胞型は液体勾配で分離されるべき全体の精巣から得られた単一細胞懸濁液を可能にする、サイズが大きく異なる。 STA-PUTメソッドは、ここに証明し、大きさや質量6-9に基づいて精子形成細胞を分離するための直線のBSA勾配とシンプルな沈降を使用しています。 FACSおよび水簸10-13：STA-PUT方法は精子形成細胞タイプを分離する他の二つの最も広く使用されている方法に勝るいくつかの利点を有する。 STA-PUT装置は、ONLが必要です寒い部屋や大きな冷蔵庫に組み立て専門のガラス器のY数枚。このように、セルソーター又は水簸機を使用するよりも安価である。 STA-PUT方法は、各細胞集団の純度はFACS 11で得られたものほど高くはないが、匹敵する時間枠内FACSによってソートすることができるよりも、細胞型および精巣あたりの細胞のより高い量をもたらす。磁気ビーズを用いて細胞選別（ソーティング磁気活性化細胞、MACS）は最近成功した混合精巣細胞集団から精原細胞の濃縮のために用いられてきたが、現在による適切な表面マーカー14についての知識の欠如のために精母細胞または精子細胞を分離するには不向きである。 MACSまたはFACSオーバーSTA-PUT方法のさらなる利点は、ほとんどのFACSプロトコルとは対照的に、それは任意のDNA染色又は他のタイプを必要としないので、その後の培養に適した生存可能な細胞を単離する能力である。 Lを必要とする研究のため精子形成細胞の種類のアーゲ収率は約90％の純度で、STA-PUTは、理想的な方法である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

哺乳類の精子形成は、精巣の精細管にいくつかの段階で発生する複雑な分化過程である。現在のところ、 インビトロでの精子形成の分化を可能にする信頼性のある細胞培養系がなく、精子形成細胞のほとんどの生物学的研究は、マウスおよびラットのような動物モデルからの組織採取を必要とする。非精子形成（ライディッヒ、セルトリ、骨髄、および上皮細胞）および精子形成の両方（精原細胞、精母細胞、円形精子細胞、精子細胞および精子を凝縮） - - 精巣は多数の細胞型が含まれているため、精子形成に関与する生物学的メカニズムの研究を隔離を必要とするこれらの異なる細胞型の富化。この場合、精巣から - - BSA線形勾配を介してSTA-PUT方法は、不均一な細胞集団の分離を可能にする。個々の細胞型は、CEのに応じて異なる沈降速度で沈降llのサイズ、および異なる細胞型について富化画分を回収し、さらなる分析に利用することができる。 STA-PUT方法は、特定の細胞選別法を用いて得ることができるように、 例えば、細胞型の高純度画分をもたらさないが、各画分中の全細胞のより高い収量を提供しない （7-8×10 8細胞の出発集団から〜1×10 8個/精子形成細胞型）。この高い収率メソッドは特殊なガラス容器を必要とし、蛍光活性化セルソーター（FACS）又は水簸機等の特殊な装置へのアクセスが限られているラボのための理想的な方法で製造する、任意の低温室又は大冷蔵庫で行うことができる。

STA-PUTプロシージャから理想的な結果は、細胞の大きさおよび密度に基づいて、精巣からの細胞のかなり目立つ分離である。精巣から単離された細胞は、BSA勾配を介して沈降しているが、細胞のいくつかの別個のバンドが観察することができる。セルのいずれか塊は勾配の底に沈むようにし、他の画分を汚染しない傾向があります。もう少し勾配までは、大規模な体細胞および減数分裂細胞?...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。

STA-PUTの速度沈降を使用して造精細胞型の分離

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K ビュー.  University of Pennsylvania.  STA-PUTメソッドは、大きさや密度に基づいて精子形成細胞の異なる集団の分離を可能にする。 

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Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

生物学

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

タンパク質の電気泳動分離

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

カエル精子の化学誘引を検出するためのアッセイの二種類

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

DNA断片の分離のためのアガロースゲル電気泳動

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

多様ChIPseqデータ型のゲノムワイドな解析のための新規ベイジアン変化点アルゴリズム

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

マウス胚性外胚葉顔と間葉の分離

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

無傷の植物をブランチングすることによって、または抽出物の熱処理によりタバコ宿主細胞タンパク質の除去方法の比較

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

細胞間接触の不在で2つの細胞タイプの挿入共培養システムの開発

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

巨大ウイルス混合物分離のための蛍光活性化細胞選別の代替戦略としての単一細胞マイクロ吸引

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...