シデロフォアは、環境中の鉄の循環に関与する低分子量、金属キレート化生体分子です。このプロトコルは土および植物のサンプルのsiderophore活動の急速なハイ・スループットの評価を可能にする。サイドロフォア検出のための以前の方法は、微生物群集の重要な環境を排除しました。
私たちの技術は、比較的無傷の微生物群集内およびそれが関与する生息地内での検出を可能にします。鉄の入手可能性は農業の生産性にとって非常に重要であるため、このプロトコルでは、植物への鉄の入手可能性を調節する微生物の役割を調査するために使用することができます。さらに、この方法は、土壌の健康とサイドロフォア生産コミュニティに対する農場管理慣行の影響と、時間の経過とともにそのようなコミュニティの発展を評価するために使用することができます。
まず、CASアッセイで使用する前に最低2時間、100ミリモル塩酸100ミリモル硝酸ですべてのガラス製品を洗浄する。実験室グレードの砂で満たされたアルミニウムベーキングパンを準備し、アルミ箔でそれをカバーしています。摂氏121度で30分間オートクレーブを取り、脇に置きます。
20ミリリットルの二重脱イオン水に0365グラムを加えてHDTMAを準備し、水浴中に37°Cで溶液を入れ、可溶化を促進します。25ミリリットルの二重脱イオン水に0302グラムのCASを加え、滅菌磁気攪拌棒で穏やかにかき混ぜます。その後、穏やかにかき混ぜ続けながら、CAS溶液の25ミリリットルに1モル塩化鉄六水和物の5ミリリットルを加えます。
今度は、20ミリリットルのHDTMA溶液を鉄CAS錯体溶液にゆっくりと加え、穏やかにかき混ぜます。15.12グラムのPIPESを375ミリリットルの二重脱イオン水に溶解して緩衝液を調製し、穏やかに攪拌します。5モル水酸化ナトリウムでpHを6.8に調整します。
その後、450ミリリットルにボリュームをもたらすために水を追加します。今、溶液にアガロースの5グラムを追加します。PIPESバッファー溶液と鉄CASの複雑な溶液を摂氏121度で30分間オートクレーブします。
鉄CAS複雑な溶液の全体を、それぞれオートクレーブされた後、バイオセーフティキャビネットのPIPESバッファ全体に慎重に追加します。混合溶液を摂氏50度の水浴に入れます。今、生物安全キャビネット内の滅菌砂に滅菌試薬ボートを置き、摂氏50度に熱します。
鉄CAS複合体寒天をボートに移し、その後すぐに透明な平底の無菌96ウェルマイクロプレートの各井戸に100マイクロリットルをアリコートします。前に調製した修正されたM9培地で800マイクロモルピオーバージン標準を調製する。溶液を400、200、100、50、25、12.5、および6.25マイクロモル溶液に希釈します。
3.2ミリモルEDTA標準を調製するために、以前に調製された修正M9培地の500ミリリットルにEDTAを加えます。この溶液を1600、800、400、200、100、50、25、12.5、および6.25マイクロモル溶液に希釈します。標準的な曲線を生成するには、100マイクロリットルの鉄CAS錯体寒天培地を含む96ウェルマイクロプレートのウェルに、ピオーバージンとEDTAの各濃度の100マイクロリットルを加えます。
各濃度の技術複製を複製します。また、M9のみで空の井戸を追加します。マイクロプレートリーダーを使用して、摂氏22度で1、6、24時間のインキュベーション後に吸光度を測定し、吸光度測定を使用して標準曲線を生成します。サンプリング装置を22ミクロンフィルター二重脱イオン水で洗浄し、その後70%エタノールを加え、ペーパータオルで拭きます。
滅菌技術を維持し、クロス汚染を低減するために、サンプリング前およびサンプル間で洗浄を行います。植物組織を切除し、畑の植物から小さな根のボールを発掘した後、実験室環境でサンプル分離のために別のラベル付きビニール袋に根球を置きます。すべてのサンプルを氷の上に直接置き、サンプルがシドロフォア生産アッセイのために処理されるまで摂氏4度に保ちます。
根に関連する土壌サンプルをバルク、緩く結合した根層圏土壌、および密接に結合した根球土壌に分離する。そのためには、根のボールを袋から取り出し、根のボールから土をそっと振り払います。土を振り払い、袋に残された土壌と共に、バルク土壌を構成する。
これは緩く結合した根球の土壌です。しっかりと結合したサンプルで根を取り、遠心分離チューブに入れることによって、しっかりと結合した根茎の土壌を生成します。2~3分間、30ミリリットルの二重脱イオン水と渦を加えます。
根を取り除き、しっかりと結合した根茎の土壌スラリー希釈を取得します。袋を開けずに可能な限り土を混合し、回すことによって、サンプルバッグ内の各土壌サンプルを均質化します。各サンプルを十分に混合した後、アリコートおよび滅菌50ミリリットル遠心管内の修飾M9培地の20ミリリットルの各土壌サンプルの2グラムを懸濁した。
サンプルを希釈し、チューブを無菌フォームプラグで密封して、エアレーションを可能にします。しっかりと結合した根球サンプルの場合、無菌50ミリリットル遠心分離管内の改変M9培地の20ミリリットルに根層圏土壌スラリーの2ミリリットルを追加します。サンプルを希釈し、チューブを無菌フォームプラグで密封して、エアレーションを可能にします。
組織試料を調製するために、表面は、70%エタノールで根、シュート、および穀物を殺菌する。30秒間高いブレンダーを使用して、20ミリリットルの修飾M9培地で2グラムの新鮮な組織をマセレートする。次いで、サンプルを無菌50ミリリットル遠心分離管に移し、希釈し、滅菌フォームプラグでチューブを密封する。
鉄の制限を通じてシドロフォアの生産を豊かにするために、室温で50ミリリットルの遠心管をインキュベートし、160 RPMで振る。濃縮培養を起算してから24、48、および72時間で、滅菌技術を用いて濃縮管から1ミリリットルのサブサンプルを除去する。2ミリリットル遠心管で1分間Gの10,000倍のサブサンプルを遠心分離し、細胞をペレット化する。
滅菌技術を使用して、重ね板内または三重に鉄CAS錯体寒天の100マイクロリットル溶液に上清の100マイクロリットルを追加します。また、無菌M9培地の100マイクロリットルをブランクとして追加します。その後、28°Cでプレートをインキュベートします。
各プレートは、インキュベーターに配置する前に、封入し、ホイルで覆う必要があります。各サンプルの残りの上清とペレットを、独自の無菌2ミリリットル遠心管に吊り下げ。各サンプル上清チューブに400マイクロリットルの無菌グリセロールを加え、ペレットを再中断してグリセロールストックを作成します。
後で分析するためにマイナス80°Cで在庫を凍結します。波長420ナノメートルで6時間、24時間、48時間、72時間で吸光度を測定します。シュードモナスフルオレセンスによって生合成されたピオーバージン混合物は、ピウオーバージン等価性のサンプル中のサンプル中のサンプルの吸光度をマイクロモルにおける解釈および定量化するための標準として使用された。
420ナノメートルの吸光度とピオバージンの開始濃度との関係をここに示す。72時間の濃縮の副腎活性を48時間インキュベーションで評価し、セドロフォア分離に対する遺伝子型およびサンプルタイプの影響を決定した。バルク土壌サンプル中の副腎動量は比較的低く、バルク土壌がサンプリングされた小麦遺伝子型間の差を示さなかった。
しかし、725遺伝子型から分離された緩やかに結合した土壌の濃縮は、マドセンと727の緩やかに結合した土壌と比較して、より大きなシデロフォア産生を示したが、レジャインからは見なかった。逆に、密結合土壌からの濃縮物におけるシドロフォア生産は、遺伝子型の影響を強く受けていない。粒組織の濃縮培養は、遺伝子型に関係なく比較的低い副腎泳動産生をもたらした。
Lewjainの芽組織の濃縮は、他の遺伝子型よりも有意に低い副腎泳動産生を持ち、725のシュート組織培養はより可変的なシドロフォア産生をもたらした。シドロフォア活性の最大の違いは、725が他のすべての遺伝子型よりも200%以上のシドロフォア活性を有する根組織濃縮培養で観察された。プロトコルを実行する上で最も課税される側面の1つは、CAS鉄の寒天マイクロプレートを生成するための多くのステップを完了しながら無菌状態を維持し、シドロフォア活性のサンプルをテストすることです。
クロマトグラフィー培養またはDNAベースの技術の広い配列は、さらなる生化学的検査または遺伝的特徴付けおよび代謝モデリングのために、実際のマイクロチターウェルまたはグリセロール保存培養のいずれかに適用することができる。このプロトコルシドロフォア活性を使用することにより、後でその活性を担う特定の生物とリンクさせることができ、その後、より大きな生態学的影響のメカニズムとして標的にすることができる。このプロトコルは、空気、水、堆積物を含む他の環境コンパートメントから収集されたサンプルから生成された濃縮培養物におけるシドロフォア生産を評価するために容易に変更することができる。
