この仕事の側面のための資金は、米国農務省の特定協力協定58-6408-1-595、国立科学財団（賞1049911）など、さまざまなソースから提供された。

土壌や堆積物中の細胞外酵素活性の比色分析 1。酵素活性の比色分析用基板及び緩衝溶液の調製<ol><li> 50ミリリットルの0.1M酢酸（2.87ミリリットル500mlの水で氷酢酸）を150 mlの0.1 M酢酸ナトリウム、およびH 2 Oを200mlの蒸留を混合することによって、50mMの酢酸緩衝液（pH 5.0〜5.5）を調製必要に応じて、0.1M酢酸で5.0〜5.5にpHを調整する。 </li><li>蒸留H 2 O中に1 M水酸化ナトリウム（NaOH）の溶液を調製</li><li> 50 mMの酢酸緩衝液中のPのNP-連結基質溶液を調製する。ホスファターゼをアッセイする50mM酢酸緩衝液中で5 mMのP NP-リン酸を準備し、β-グルコシダーゼは5 mMのP NP-β-グルコピラノシドを準備アッセイするナガセは2 mMのPNP-β-N-acetylglucosaminideを準備アッセイする。無菌15ミリリットルまたは50ml遠心チューブ内のすべての基質溶液を準備します。溶液は2〜3週間、4℃で保存することができる。 </li></ol> 2。 Pの NP濃度に吸光度を変換するための標準の決定<ol><li> 50mM酢酸緩衝液中のp-ニトロフェノールの標準溶液を調製する。濃度は、MM 0.025から1の範囲であるべきである。 </li><li>透明な96ウェルマイクロプレートへの転送各濃度の100μLの3回の反復を。各ウェルに、H 2 Oを蒸留10μlの1 M NaOHおよび190を添加する。 </li><li>マイクロプレートリーダーを用いて410nmでの記録的吸光度。 </li><li> 0.3による標準曲線で増殖濃度は、300μlの反応体積あたりのマイクロモルのp NPを取得します。 Pの NPのマイクロモル対吸光度の曲線をプロットします。曲線の傾きは、各酵素反応でのp NPの吸光度をμモルに関連するであろう変換係数（C）となる。 </li></ol> 3。酵素アッセイを実施<ol><li>土壌については、concentrで15mlの滅菌遠心管にアッセイされる各試料のスラリーを調製約1グラム/ミリリットル-1 50mM酢酸緩衝液を使用することのATION。堆積物については、スラリーを簡単にpipettable作るのに十分な酢酸緩衝液を追加します。必要なスラリーの正確な量は、アッセイの酵素の数に応じて異なるが、5ミリリットルの最小を推奨します。渦土壌や堆積物のすべての塊が分散し、最終容量に注意してまで、各スラリー。 </li><li>再渦各スラリーし、すぐに96ウェルディープウェルブロック（ 図1）上の6ウェルのそれぞれに150μlのピペット。これは、懸濁液中の土壌粒子を維持するために十分に、頻繁にボルテックスすることが重要である。基板制御として機能するために、空のブロックごとに少なくとも2つのウェルを残す。注意：土壌スラリーはヒントを詰まらせる傾向があるので、前にピペッティングをハサミでピペットチップの端をクリップする。アッセイすべき各酵素の1 96ウェルブロックを準備します。 </li><li>ピペットリザーバ内の酢酸緩衝液約5ミリリットルを注ぎ、Lに150μlのバッファーを追加するには、8チャンネルピペッターを使用各試料の2つのウェル（これらは、サンプルバッファコントロールなる）と2つの基板のコントロールとなるウェル（ 図1）はast </li><li>ピペットリザーバに適切なPのNP-基質溶液を約10ミリリットルを注ぎ、（ 図1）、各サンプルの最初の4つのウェルと2基板制御ウェルに基質溶液150μlを追加するには、8チャンネルピ ​​ペッターを使用しています。反応は、すぐに基質溶液を添加するとして始まり、時間に注意してください。 </li><li> 0.5〜4時間、室温（22℃）で培養する。正確なインキュベーション時間は、活性が試料中のレベルとアッセイされるべき酵素に依存して変化する。長瀬他の酵素は、&gt; 2時間のインキュベーション時間を必要とするのに対し、ほとんどの土壌や堆積物の場合は、ホスファターゼ、β-グルコシダーゼは、0.5〜1.5時間のインキュベーション時間を必要とする。 </li><li>アッセイは、吸光度の読み取りにマイクロプレート透明な96ウェルを準備インキュベートされている。 （ すなわち 、各Eに対する各ディープウェルブロックごとに1マイクロプレートを準備しますnzyme）アッセイした。ピペット10μlの1 M NaOHで、マイクロプレートの各ウェルに蒸留水190μL。注：NaOHを酵素反応を遅くし、NPは、反応中に放出されたpの色を強化し、pHを上昇させる。 </li><li>インキュベーション後、土壌粒子をペレット化し、5分間2,000〜5,000×gで96ウェルブロックを遠心する。 </li><li>ペレットを与えないように注意しながら、各ウェルから100μlのを撤回するマルチチャンネルピペットを使用して、準備明確な96ウェルマイクロプレートに対応するウェルに移す。 </li><li>マイクロプレートリーダーの電源をオンにし、必要なソフトウェアをセットアップします。 410 nmの吸光度を記録。特定のウェルの吸光度はプレートリーダーの直線検出限界を超えている場合、水と再測定値とそのウェル1:1に希釈する。吸光度は依然として高すぎる場合、アッセイは、より短いインキュベーション時間で繰り返されるべきである。 </li></ol> 4。サンプルの乾燥質量の決定<ol><li>各SAMPLのピペット1ミリリットル<html>予め秤量したアルミニウム製パンにEスラリー。 </li><li> 48時間75℃の乾燥炉内の乾燥と比較検討する。スラリーの1ミリリットルの土壌や堆積物の乾燥質量を得るために、この値から、パンの重量を差し引く。酵素アッセイにおいて、各ウェルに添加し、150μlの試料の乾燥質量を決定するために0.15の係数で乗算する。 </li></ol> 5。土壌や堆積物の乾燥質量あたりの酵素活性の計算<ol><li>サンプルアッセイ吸光度からサンプル制御吸光度を差し引くことにより、各試料の最終吸光度を計算します。基板のコントロールは高い吸光度（およそ&gt; 0.060）がある場合、また、それらを引きます。 </li><li> μモル時間で酵素活性を算出-1グラム乾燥質量を-1方程式から： </li></ol>酵素活性=最終吸光度/（C xのインキュベーション時間×サンプル乾燥質量） 天然水中の細胞外酵素活性の蛍光分析酵素活性の蛍光分析用基板、標準、およびバッファソリューション&gt; 1。準備TLE」 <ol><li>無菌に適切な基質を溶解させることによりMUB-連結基板（ 例えば 4-MUB-β-グルコピラノシド、4 - MUB -リン酸、4 - MUB-N-アセチル-β-D-グルコサミニド）の200μMの溶液を調製する（オートクレーブ処理）蒸留15mlの滅菌又はを50ml遠心管中のH 2 O。光を排除し、使用前に冷蔵庫に保存するためにアルミホイルでチューブを包みます。この方法で保存した場合の基板は、少なくとも1週間は安定であるべきである。 </li><li>滅菌蒸留H 2 O中の100μMの4 -メチルウンベリフェロンの原液を作ることでMUB標準を準備するストアは琥珀色、またはアルミホイルにくるまれた瓶の中に冷蔵した。使用直前に、酵素アッセイのために10μMの作業溶液を作るために、滅菌H 2 O中に1/10、100μMのストック溶液を希釈する。 </li><li>のNaHCO &lt;8.4gを溶解することによって100mMの重炭酸塩緩衝液のストック溶液を調製サブ&gt; 3 1 LH 2 O、オートクレーブに。酵素アッセイのための5mMの作業溶液を作製するために、必要に応じて、滅菌を H 2 Oに、この原液を1/20に希釈する。 </li></ol> 2。 96ウェル黒色マイクロプレート上の編成水試料<ol><li> 図2に示した例以下の各酵素のためのマイクロプレートを整理。十分な複製、標準、およびコントロールを可能にこの手順は1 96ウェル黒色マイクロプレート上で最大9水のサンプルのための単一の酵素の活性を測定できることに注意してください。 </li><li>ピペットリザーバーに最初のサンプルの約5ミリリットルを注ぎ、マイクロプレート（S）のカラム1のウェルの全てにμLpipette200する8チャンネルピペッターを使用しています。使用済みのピペットチップを破棄し、列1-9を埋めるために、各試料水のために必要に応じて繰り返します。 </li></ol> 3。サンプル、標準、急冷し、基板コントロールの設定<ol><li>標準試料を考慮して制御を設定サンプルと同じ黒色マイクロプレート（ 図2）のS、基板焼入れ。 </li><li>サンプルコントロールは試料水と重炭酸塩緩衝液を含んでおり、活動の計算に使用されていないが、実験の過程全体の一貫性を読んでデモンストレーションを行います。急冷コントロールは、サンプル水および蛍光タグの標準量からなり、試料水中の蛍光の回折を測定するために使用される。基板と標準コントロールは、基板結合またはそれぞれの標準蛍光タグ、および重炭酸塩緩衝液のどちらかで構成されています。 </li><li>きれいなピペットリザーバーに5 mMの重炭酸塩緩衝液約5ミリリットルを注ぐ。サンプルあたりのサンプルコントロールの2反復ウェルを形成する行DとEでのマイクロプレートウェルに緩衝液をピペット50μlの1〜9。チェンジピペットチップはその後10〜12行を通してウェルに重炭酸塩緩衝液200μlを移すAとH. </li><li>李調光またはオフにすることで、周囲の照明を減らす蛍光標準としてGHTSは光に敏感である。 </li><li>きれいなピペットリザーバーに10μMの4 - メチルウンベリフェロンの約5ミリリットルを注ぐ。クエンチサンプルあたりのコントロールと、全体的な標準のコントロールの3回の反復を形成する行GおよびFへのマイクロプレートウェルにピペット50μL行のH 1〜12、およびウェルに1〜9。暗闇の中でマイクロプレートを置くか、MUBの光劣化を低減する不透明な蓋をかぶせどちらか。 </li><li>蛍光光度計の電源を入れ、セットアップし、必要なソフトウェアを基質を添加する前に必ずお読み準備ができている。注：一部の蛍光光度電球は3分以上のウォームアップ時間が必要な場合があります。 </li><li>きれいなピペットリザーバに適切なMUB-連結基質（ 例えば 4-MUB -リン酸）を約5ミリリットルを注ぐ。各試料の3つの複製アッセイおよび3基板のコントロールを形成するために、1行のBおよびC 1〜9行Aの12を通ってマイクロプレートウェルに50μlのピペット、およびウェルにするために12チャンネルピペッターを使用してください。 ImmediatelYは、蛍光を記録し、4.1に進みます。 </li></ol> 4。記録蛍光<ol><li>直ちにマイクロプレートへの基質添加後の初期の蛍光を読む。蛍光を読んだ後、いずれかの暗いまたはMUBの光劣化を低減するために、不透明な蓋で覆われた中で（22°C）RTでマイクロプレートをインキュベートする。 </li><li>水サンプル中の最大の潜在的酵素活性を測定するために必要なインキュベーション時間は、試料内の酵素濃度に依存するであろう。アッセイを完了する前に、これが不明であるため、マイクロプレートは、複数の時間ステップで読み出されなければならない。ある種の酵素のための非常に高い活性を持つサンプルは10分前のピークかもしれないが、通常、1時間にわたって10〜15分間隔で読み取ると、多くの酵素が許容される。 </li><li>少なくとも1時間、ご指定の時間間隔で、マイクロプレートの蛍光を読み続ける。読書の間、マイクロプレートカバーや暗闇の中を保つようにしてくださいS。 </li></ol> 5。水の容量あたりの酵素活性の計算<ol><li>初期サンプル蛍光（ウェルDおよびE）を意味する、平均最終試料の蛍光（ウェルAC）、平均±標準蛍光（ウェルH10-11）、および平均は対照蛍光を消光（ウェル：各時間間隔で各試料について計算するFG）。 </li><li>各時間間隔については、ナノモル時間で酵素活性を算出-1 ml -1の式から： </li></ol>酵素活性=（サンプル平均蛍光 - 初期サンプル平均蛍光）/（（）HRの時間（x）を0.2ミリリットル（標準的な蛍光）×平均/制御蛍光を消光意味（標準的な蛍光/ 0.5モル）×平均） <ol start="3"><li>各時間ステップに対して計算活性値を調べてください。最も高い活性を持つ時間ステップからの最終的な潜在的活性を決定する。活性値が増加し続ける場合は、後の時間ステップが必要になることがあり、活性値が落ちた場合をthrougホウトランのコースは、より短い時間ステップで再度実行してください。最終的な活性は、基質が消費時間-1 -1ミリリットルのナノモルであるが、時間-1 Lは-1マイクロモルとして表現するためにスケールアップすることができます。 </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland.">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li><li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp.">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li><li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest.">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li><li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition.">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li><li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain.">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

土壌や堆積物中の微生物の細胞外酵素の様々な活性を測定することは、栄養無機化と有機物処理17の速度に有益な洞察を提供することができます。しかし、土壌はそれらの水分レベルで変化させることができるので、土壌の乾燥重量に対して活性を標準化することが重要である。これは単に、酵素活性を測定することを越えて（典型的には2日間の）追加の乾燥工程を必要とする。こ?...

細菌や真菌などの微生物は、細胞外酵素の産生を介して複雑な有機化合物からの栄養と炭素を得る。これらの酵素は、典型的には、細胞内に取り込まれ得るより小さなサブユニットにポリマーを加水分解する。そのため、生態系のレベルでは、これらの微生物の細胞外酵素は、栄養の石灰化や自然環境の中で発生する有機物分解の多くを担当している。このようなビオヒドロラーゼ（CBH）およびβ-グルコシダーゼなどの酵素は、微生物の取り込みや同化のための利用可能な炭素基材を提供する1,2グルコースへのセルロースの加水分解を触媒するために一斉にセルロース分解や仕事のために重要である。有機リン酸からの酵素ホスファターゼ放出性無機リン酸基、本質的にリン酸塩を鉱化し、ほとんどの生物3による使用に利用可能にする。例えば、N-アセチル（ナガセ）のような他の酵素は、importanですTキチン分解における微生物の取得4用の炭素と窒素の両方を利用できるようにすることができます。 自然環境中の微生物の細胞外酵素活性のアッセイのための手順のいずれかは人工的なp-ニトロフェニル（p個の NP）の使用は、本来の土壌5ホスファターゼ活性を検出するために開発されたアプローチの基板を連結している。このアプローチは、人工基質を適切な酵素によって加水分解されるときに放出される着色最終生成物、p-ニトロフェノールの検出に依存する。 p-ニトロフェノールは、その後、周りの400〜410nmでの吸光度を測定することによって比色定量することができる。この方法は、例えば、日時のNAGase 6のような他の酵素を検出するために適用されており、土壌や堆積物7-9中の微生物細胞外酵素活性を調べる様々な研究で使用されている。 originallた別のアプローチyは10,11が 4 -メチルウンベリフェロン（MUB）連結された基材を使用する水環境における細胞外グルコシダーゼ活性を評価するために開発された。 （4 - メチルウンベリフェロン）放出最終生成物は、高度に蛍光性であり、460分の360付近の励起/発光の設定で蛍光光度計を用いて検出することができる。 MUB連動人工様々な基材は、P NP-基質比色手順を用いてアッセイすることができるように少なくとも同じ数の酵素（ 例えば 、β-グルコシダーゼ、ビオヒドロラーゼ、長瀬ホスファターゼ）の活性の蛍光測定を可能に用意されています。このようなタンパク質分解ロイシンアミノペプチダーゼのような他の微生物の細胞外酵素は、7 - アミノ-4 - メチルクマリン（COU）リンクされた基質を用いて蛍光定量的にアッセイすることができる。両方MUB-とカップリンクされた基板は、様々な陸上および水生サンプル12,13中の酵素活性を測定するために使用されている。 これまでの研究では、一行コメントがありますがアイベッド蛍光または比色マイクロプレートは、細胞外酵素活性14を決定するために近づくと、このようなアッセイを実施する方法の明確なプレゼンテーションが必要とされている。ここでは、比色Pの NP-連結基板アプローチを使用して土壌と堆積物中の蛍光MUB-連結基板技術を用いて、天然水中の細胞外酵素活性の分析のためのハイスループットマイクロプレート法を実施するための手順を示しています。我々は、β-グルコシダーゼ、のNAGaseの活性の測定に注目し、これらの酵素のようなホスファターゼは、それぞれ、炭素、窒素、およびリン循環に接続することができる。しかしながら、ここで説明する手順は、異なる人工基質を用いて他の細胞外酵素の測定に適用することができる。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS AND MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP612-1</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N3234</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N7006</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>pNP-&beta;-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N9376</td>
			<td>pNP-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Clear 96-well microplates</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-563-301</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96-well deep well blocks</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3958</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Aluminum weigh pans</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile 50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8883</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3633</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-MUB-N-acetylglucosaminide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2133</td>
			<td>MUB-substrate</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96-well microplate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3792</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-81</td>
			<td>For microplates/deep-well blocks</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Synergy HT</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microplate fluorometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>FLx 800</td>
			<td>Alternates available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>8-channel pipettor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Various suppliers</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

determination of microbial extracellular enzyme activity in waters, soils, and sediments using high throughput microplate assays

自然環境での栄養循環と炭素処理の多くは、微生物が発表した細胞外酵素の活性を介して行われます。従って、これらの細胞外酵素の活性の測定は、このような有機物分解または窒素およびリンの石灰化などのエコシステムレベルプロセスの速度への洞察を与えることができる。環境試料中の細胞外酵素活性のアッセイは、典型的には人工的な比色または蛍光基質にサンプルを曝露し、基質加水分解の速度を追跡することを含む。ここでは、短い時間枠内で多数のサンプルの分析を可能にするこれらの手順のために、マイクロプレートベースの方法を記載している。サンプルを、ディープウェルマイクロプレート·ブロック96ウェルマイクロプレート内で人工的基質と反応させ、酵素活性は、その後、標準的なマイクロプレートReadeのを使用して得られた最終生成物の吸収または蛍光によって決定されるRまたは蛍光光度計。そのようなハイスループットの手順は、空間的に別個の部位又は生態系間の比較を容易にするだけでなく、実質的にサンプルごとに必要な全体的な試薬容量を低減することによりそのようなアッセイのコストを低減するだけでなく。

土壌や水生堆積物は、一般的に粒子の表面上に成長して付着した微生物群集（バイオフィルム）の結果として、細胞外酵素活性のかなりのレベルを持っている。第三の表層堆積物から得られた粒子の大きさによっては、この活動がどのように変化するかを図3に示す図北部ミシシッピ州、米国の順ストリーム。以前の研究では、このストリームからの堆積物の粒子上?...

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Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

マイクロプレートベースの手順は、細胞外酵素活性の比色または蛍光分析に記載されている。これらの手順は、管理可能な時間枠内で環境サンプルの大規模な数のこのような活動の迅速なアッセイを可能にします。

ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

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Research

JoVE Journal

Environment

38.4K ビュー.  The University of Mississippi. マイクロプレートベースの手順は、細胞外酵素活性の比色または蛍光分析に記載されている。これらの手順は、管理可能な時間枠内で環境サンプルの大規模な数のこのような活動の迅速なアッセイを可能にします。 

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High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be assimilated for energy and nutrients. Measuring soil microbial enzyme activity is crucial in understanding soil ecosystem functional dynamics. The general concept of the fluorescence enzyme assay is that synthetic C-, N-, or P-rich substrates bound with a fluorescent dye are added to soil samples. When intact, the labeled substrates do not fluoresce. Enzyme activity is measured as the increase in fluorescence as the fluorescent dyes are cleaved from their substrates, which allows them to fluoresce. Enzyme measurements can be expressed in units of molarity or activity. To perform this assay, soil slurries are prepared by combining soil with a pH buffer. The pH buffer (typically a 50 mM sodium acetate or 50 mM Tris buffer), is chosen for the buffer&#39;s particular acid dissociation constant (pKa) to best match the soil sample pH. The soil slurries are inoculated with a nonlimiting amount of fluorescently labeled (i.e. C-, N-, or P-rich) substrate. Using soil slurries in the assay serves to minimize limitations on enzyme and substrate diffusion. Therefore, this assay controls for differences in substrate limitation, diffusion rates, and soil pH conditions; thus detecting potential enzyme activity rates as a function of the difference in enzyme concentrations (per sample).
Fluorescence enzyme assays are typically more sensitive than spectrophotometric (i.e. colorimetric) assays,&#160;but can suffer from interference caused by impurities and the instability of many fluorescent compounds when exposed to light; so caution is required when handling fluorescent substrates. Likewise, this method only assesses potential enzyme activities under laboratory conditions when substrates are not limiting. Caution should be used when interpreting the data representing cross-site comparisons with differing temperatures or soil types, as in situ soil type and temperature can influence enzyme kinetics.

To measure potential rates of soil extracellular enzyme activities, synthetic substrates that are bound to a fluorescent dye are added to soil samples. Enzyme activity is measured as the fluorescent dye is released from the substrate by an enzyme-catalyzed reaction, where higher fluorescence indicates more substrate degradation.

潜在的な土壌菌体外酵素の活動のハイスループット蛍光測定

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

環境学

Measurement of Greenhouse Gas Flux from Agricultural Soils Using Static Chambers

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the biogeochemical drivers of climate change and to the development and evaluation of GHG mitigation strategies based on modulation of landscape management practices. The static chamber-based method described here is based on trapping gases emitted from the soil surface within a chamber and collecting samples from the chamber headspace at regular intervals for analysis by gas chromatography. Change in gas concentration over time is used to calculate flux. This method can be utilized to measure landscape-based flux of carbon dioxide, nitrous oxide, and methane, and to estimate differences between treatments or explore system dynamics over seasons or years. Infrastructure requirements are modest, but a comprehensive experimental design is essential. This method is easily deployed in the field, conforms to established guidelines, and produces data suitable to large-scale GHG emissions studies.

This article showcases the static chamber-based method for measurement of greenhouse gas flux from soil systems. With relatively modest infrastructure investments, measurements may be obtained from multiple treatments/locations and over timeframes ranging from hours to years.

静的チャンバを用いて農用地の土壌からの温室効果ガスフラックスの測定

Measurement of greenhouse gas (GHG) fluxes between the soil and the atmosphere, in both managed and unmanaged ecosystems, is critical to understanding the ...

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

上向流嫌気性スラッジブランケット炉内の海洋堆積物やトリクロロエチレンの削減からSulfidogenic汚泥の開発

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.

Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.

リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Sediment Core Sectioning and Extraction of Pore Waters under Anoxic Conditions

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is built and can be transported to a temporary work space close to field sampling site(s) to facilitate rapid analysis. Cores are extruded into a portable glove bag, where they are sectioned and each 1-3 cm thick section (depending on core diameter) is sealed into 50 ml centrifuge tubes. Pore waters are separated with centrifugation outside of the glove bag and then returned to the glove bag for separation from the sediment. These extracted pore water samples can be analyzed immediately. Immediate analyses of redox sensitive species, such as sulfide, iron speciation, and arsenic speciation indicate that oxidation of pore waters is minimal; some samples show approximately 100% of the reduced species, e.g. 100% Fe(II) with no detectable Fe(III). Both sediment and pore water samples can be preserved to maintain chemical species for further analysis upon return to the laboratory.

A protocol for sectioning sediment cores and extracting pore waters under anoxic conditions in order to permit analysis of redox sensitive species in both solids and fluids is presented.

無酸素状態下での堆積物コアセクショニングと間隙水の抽出

We demonstrate a method for sectioning sediment cores and extracting pore waters while maintaining oxygen-free conditions. A simple, inexpensive system is ...

Clean Sampling and Analysis of River and Estuarine Waters for Trace Metal Studies

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination control. Developments of some techniques aiming to reduce trace metal contamination in the last couple of decades have resulted in concentrations reported now being orders of magnitude lower than those in the past. These low concentrations often necessitate preconcentration of water samples prior to instrumental analysis of samples. Since contamination can appear in all phases of trace metal analyses, including sample collection (and during preparation of sampling containers), storage and handling, pretreatments, and instrumental analysis, specific care needs to be taken in order to reduce contamination levels at all steps. The effort to develop and utilize "clean techniques" in trace metal studies allows scientists to investigate trace metal distributions and chemical and biological behavior in greater details. This advancement also provides the required accuracy and precision of trace metal data allowing for environmental conditions to be related to trace metal concentrations in aquatic environments.
This protocol that is presented here details needed materials for sample preparation, sample collection, sample pretreatment including preconcentration, and instrumental analysis. By reducing contamination throughout all phases mentioned above for trace metal analysis, much lower detection limits and thus accuracy can be achieved. The effectiveness of "clean techniques" is further demonstrated using low field blanks and good recoveries for standard reference material. The data quality that can be obtained thus enables the assessment of trace metal distributions and their relationships to environmental parameters.

Special care using "clean techniques" is required to properly collect and process water samples for trace metal studies in aquatic environments. A protocol for sampling, processing, and analytical procedures with the aim of obtaining reliable environmental monitoring data and results with high sensitivity for detailed trace metal studies is presented.

きれいなサンプリングと微量金属の研究のために川や河口ウォーターズの分析

Most of the trace metal concentrations in ambient waters obtained a few decades ago have been considered unreliable owing to the lack of contamination ...

A Bending Test for Determining the Atterberg Plastic Limit in Soils

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a considerable subjective judgment from the operator that carries out the test is involved during its performance, which may affect the final result significantly. Different alternative methods have been put forward, but they cannot compete with the standard rolling test in speed, simplicity and cost.
In an earlier study by the authors, a simple method with a simple device to determine the PL was presented (the &#34;thread bending test&#34; or simply &#34;bending test&#34;); this method allowed the PL to be obtained with minimal operator interference. In the present paper a version of the original bending test is shown. The experimental basis is the same as the original bending test: soil threads which are 3 mm in diameter and 52 mm long are bent until they start to crack, so that both the bending produced and its related moisture content are determined. However, this new version enables the calculation of PL from an equation, so it is not necessary to plot any curve or straight line to obtain this parameter and, in fact, the PL can be achieved with only one experimental point (but two experimental points are recommended).
The PL results obtained with this new version are very similar to those obtained through the original bending test and the standard rolling test by a highly experienced operator. Only in particular cases of high plasticity cohesive soils, there is a greater difference in the result. Despite this, the bending test works very well for all types of soil, both cohesive and very low plasticity soils, where the latter are the most difficult to test via the standard thread rolling method.

The traditional standardized test for determining the plastic limit in soils is performed by hand, and the result varies depending on the operator. An alternative method based on bending measurements is presented in this study. This allows the plastic limit to be obtained with a clear and objective criterion.

土壌にAtterberg塑性限界を決定するための曲げ試験

The thread rolling test is the most commonly used method to determine the plastic limit (PL) in soils. It has been widely criticized, because a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

土壌中の微生物のリン脂質脂肪酸の抽出と分析

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

森林土壌の化学濃度の変化を監視するための土壌リサンプリングの方法

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Different sulfur isotope compositions of authigenic pyrite typically result from the sulfate-driven anaerobic oxidation of methane (SO4-AOM) and organiclastic sulfate reduction (OSR) in marine sediments. However, unravelling the complex pyritization sequence is a challenge because of the coexistence of different sequentially formed pyrite phases. This manuscript describes a sample preparation procedure that enables the use of secondary ion mass spectroscopy (SIMS) to obtain in situ &#948;34S values of various pyrite generations. This allows researchers to constrain how SO4-AOM affects pyritization in methane-bearing sediments. SIMS analysis revealed an extreme range in &#948;34S values, spanning from -41.6 to +114.8&#8240;, which is much wider than the range of &#948;34S values obtained by the traditional bulk sulfur isotope analysis of the same samples. Pyrite in the shallow sediment mainly consists of 34S-depleted framboids, suggesting early diagenetic formation by OSR. Deeper in the sediment, more pyrite occurs as overgrowths and euhedral crystals, which display much higher SIMS &#948;34S values than the framboids. Such 34S-enriched pyrite is related to enhanced SO4-AOM at the sulfate-methane transition zone, postdating OSR. High-resolution in situ SIMS sulfur isotope analyses allow for the reconstruction of the pyritization processes, which cannot be resolved by bulk sulfur isotope analysis.

Preparation of Authigenic Pyrite from Methane-bearing Sediments for In Situ Sulfur Isotope Analysis Using SIMS

Analyses of the sulfur isotopic composition (&#948;34S) of pyrite from methane-bearing sediments have typically focused on bulk samples. Here, we applied secondary ion mass spectroscopy to analyze the &#948;34S values of various pyrite generations to understand the diagenetic history of pyritization.