強化された酵母ワンハイブリッドアッセイの目的は、目的のDNA配列に結合する転写因子のセットを特定することです。この技術の利点は、強化された酵母ワンハイブリッドアッセイが1回の実験で1000以上の転写因子を評価できることである。逆に、クロマチン免疫沈降は一度に1つの転写因子のみを評価する。
この方法は、遺伝子プロモーターおよびエンハンサーに結合する転写因子のレパートリーを同定し、非コード変異体に結合する転写因子を同定するための機能的ゲノミクスのための重要なツールを構成する。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクです。氷の上にTF獲物配列で酵母グリセロールストックプレートを解凍します。
12チャネルピペットを使用して酵母を再懸濁し、1〜3分以内に次のステップに進みます。酵母をScマイナストリプトファン長方形プレートにスポットするには、高密度アレイロボットを使用してマルチウェル96プレートをソースとして、96枚の寒天プレートをターゲットに、96個のロングピンパッドを選択します。ピンパッドは再利用可能ではなく、廃棄する必要があります。
96ウェルプレートごとに2つのコピーを作成するには、スポット多プログラムを選択します。冷凍在庫の逆汚染を避けるために、リサイクルまたは再訪オプションを使用しないでください。また、酵母を混合するためにソースで上下に旋回するオプションを選択します。
プレートを配置する場所とタイミングの指示に従い、ロボットが酵母をScマイナストリプトファンの長方形プレートに見つけることができます。斑点のあるアレイを袋に入れ、摂氏30度で寒天側を2〜3日間インキュベートします。Scからトリプトファンの長方形プレートを引いた384コロニーアレイを生成するには、ソースとして96寒天プレート、ターゲットとして384寒天プレート、および96の短いピンパッドを選択します。
次に、1:4 配列の単一ソース・プログラムを選択します。このようにして、4つの96コロニープレートが1つの384コロニープレートに統合されます。異なるプレート間の汚染を避けるために、リサイクルまたは再訪オプションを使用しないでください。
プレートを袋に入れ、斑点のある384コロニーアレイ寒天側を摂氏30度で2日間インキュベートします。Scからトリプトファンの長方形のプレートを引いた1536コロニーアレイを生成するには、ソースとして384寒天プレート、ターゲットとして1536寒天プレート、および384の短いピンパッドを選択します。次に、1:4アッセイ単一ソースプログラムを選択します。
目標は、4倍を得るために4つのコロニーに各コロニーをコピーすることです。リサイクルと再訪のオプションは、コロニーごとに4回コピーする必要があります。ロボットの指示に従い、ロボットがプレートに酵母を見つけてから、発見された1536コロニーアレイ寒天側を30°Cで30°Cで30°Cでインキュベートします。
Scからトリプトファンの長方形のプレートを引いた1536コロニーアレイを増幅するには、ソースとして1536寒天プレート、ターゲットとして1536寒天プレート、および1536短いピンパッドを選択します。3 ~ 4 個のコピーをレプリケートするには、[多を複製] プログラムを選択します。リサイクルと再訪のオプションを使用しますが、クロスコンタミネーションを避けるためにアレイの別のプレートに切り替えるときにパッドを投げ出します。
ロボットがScからトリプトファンの長方形のプレートを引いた1536コロニーアレイを増幅することを可能にする。最後に、プレートを袋に入れ、斑点のある1536コロニーアレイ寒天側を摂氏30度で30日間インキュベートし、交配ステップに使用します。交配のためのDNAベイト株芝生を準備するには、ScマイナスウラシルとヒスチジンプレートにDNA酵母餌株を見つけ、摂氏30度で3日間成長させます。
各プレートが12〜16種類の異なる株に収まるように、滅菌爪楊枝を使用して15センチメートルScマイナスウラシルとヒスチジンプレートに酵母をストリーク。1日30度でプレートをインキュベートします。翌日、各プレートが4つの異なる株に収まるように、滅菌爪楊枝を使用して15センチメートルScマイナスウラシルとヒスチジンプレートに酵母をストリーク。
30°Cで1日プレートをインキュベートします。インキュベーションに続いて、無菌爪楊枝を使用して酵母を削り取り、寒天を削らないようにします。500マイクロリットルの無菌水で1.5ミリリットルのチューブに酵母を加えます。
YAPDの長方形の板に10から15の無菌ガラスビーズおよび酵母懸濁液を加える。酵母がプレート全体に広がるように、すべての方向に1分間徹底的に振ります。すぐにプレートを反転し、ビーズが蓋に行くようにタップします。
ビーズを取り外してリサイクルします。プレートを袋に入れ、寒天側を摂氏30度で1〜2日間インキュベートします。次に、交配ステップに進みます。
酵母DNAベイトとTFアレイ株を交尾するには、TFアレイをロボットと一緒にYAPD長方形プレートに移します。ソースとターゲットとして1536寒天プレート、および1536短いピンパッドを選択します。[多回複製] プログラムを選択します。
4つのソースプレートとリサイクルと再訪のオプションを選択します。各TFアレイプレートは、3〜4 YAPDプレートを転送するために使用することができます。交配に使用されるTFアレイプレートは2〜3日前でなければなりませんが、交配が非効率的である可能性があるため、それ以上はできません。
DNA餌株の芝生を既にTFアレイを含むYAPDプレートに移す場合は、ソースとして1536寒天プレートを選択し、ターゲットと1536短いピンパッドを選択します。[多回複製] プログラムを選択します。同じ場所から酵母を取らないように半径約0.6ミリメートルのソースでランダムなオフセットを使用し、酵母株間の接触を容易にするためにターゲット上のミックスを選択します。
DNA餌株を含む芝生をソースとして使用し、プレートを袋詰めして寒天側を摂氏30度で1日インキュベートする前に、斑点のあるTFアレイを含むYAPDプレートをターゲットとして使用します。二倍酵母の選択のために、ソースとターゲットとして1536寒天プレートを選択し、1536短いピンパッドを選択します。[レプリケート]プログラムを選択します。
[ソースとターゲットでミックス]を選択します。ロボットがYAPDプレートからScマイナスウラシルとトリプトファンプレートに交尾酵母を移してから、プレートを袋詰めし、寒天側を摂氏30度で2〜3日間インキュベートします。次に、ソースとして1536寒天プレートとターゲットと1536短いピンパッドを選択します。
[レプリケート]プログラムを選択します。ロボットを使用して、Scからウラシルとトリプトファンプレートから読み出し長方形の3-ATおよびX-gal含有プレートにディプロイド酵母を移します。プレートを袋に入れ、寒天側を摂氏30度で最大7日間インキュベートします。
バックグラウンドレポーター活性の高いDNA餌株については、2日目、3日目、4日目に写真を撮ります。それ以外の場合は、4 日目と 7 日目に写真を撮ります。TFアレイプレートを室温に保ち、7日後に再びコピーして新しいスクリーニングを行います。
強化された酵母ワンハイブリッドアッセイを用いて得ることができる結果の種類を例示するために、CCL15およびIL17F遺伝子のプロモーター領域を、1086個のヒトTFの配列に対してスクリーニングした。CCL15プロモーターは、非自己活性DNA餌の一例であり、そこでは、弱いものであっても、相互作用を容易に検出することができる。IL17Fプロモーターは、一部の相互作用を検出できる不均一なバックグラウンドレポーター活性を有する自己活性DNA餌の一例であり、いくつかのTFについては、レポーター活性がバックグラウンドよりも高いかどうかは不明である。
強化された酵母ワンハイブリッドアッセイを行う際に発生する可能性のあるいくつかの問題があります。この場合、コロニーが小さすぎて、転送に失敗しました。典型的には、TFの約95%の捕食コロニーが正常な成長を示す。
この例では、プレートの一部に酵母の増殖はない。この問題は、一般的に、1536ピンパッドがDNAベイト株芝生、TFアレイ、または交配プレート内の酵母と接触しなかった場合の交配ステップの障害に関連する。これら 2 つの例では、相互作用は検出されません。
この問題は、レポーター遺伝子の意図しない不活性化突然変異、特にLacZ、または相互作用を隠す自己活性が高すぎるかに関連していることが多い。この場合、プレートは、細菌汚染にしばしば関連するランダムな青色の斑点を提示する。考慮すべき最も重要なことは、適切なプレートの準備です。
すべてのコンポーネントが追加され、その後のすべての手順がこれに依存するので、寒天の高さが均一であることを確認します。ほとんどの試薬は危険ではありませんが、サンプルやプレートの汚染を避けるために常に手袋を着用することが重要です。DNA結合アッセイと同様に、レポーターアッセイ、転写因子のノックダウン、ノックアウトなどの機能アッセイを使用して同定された相互作用を検証し、その後に標的遺伝子の発現を測定することが重要です。
この方法により、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子を調節する転写因子と、非コード性疾患関連変異体に対する代替結合を有する転写因子を同定することができた。
