こんにちは、私の名前はバルトロメオ・ボスコで、イタリアのトレント大学統合生物学センターの転写ネットワーク研究所の博士課程の学生です。ご存知のように、転写は、転写因子と補因子の空間的および時間的な組織を含む非常に複雑なプロセスです。それらのほとんどは、ヒトP53を含め、応答元素と呼ばれる特異的なシス作用要素を認識し、このDNAシーケンシングに対する結合は、標的遺伝子の転写の変調に必要である。
本研究では、酵母をモデル系として、色レポーター遺伝子やルシファーゼのタンパク質として、あるいは細胞増殖の定量化に関するトランス活性化関数に特異的なP53配列を研究するプロトコルを紹介し、これらのアプローチの主な実験ステップと多様性を強調したいと思います。プロトコル1は、アデニン−2またはホタルルシファーゼ遺伝子の上流に特異的なP53応答要素を含むレポーター酵母株の構築である。レポーター株を構築するために、まず、所望のプロモーター領域を標的とするオリゴヌクレオチドを有する酵母細胞を変換するステップ1.1〜1.15に従う。
この変換は、標準的な酢酸リチウムベースのプロトコルに基づいています。5-FOAプレートに変形が現れたら、通常30度で3日間のインキュベーションの後、レプリカは非選択的なYPDAプレート上にそれらをプレートし、またG418を含むYPDAプレート上に、その後の比較を容易にするために各プレートをマークします。プレートを一晩30度でインキュベートします。
翌日、G418感受性であるがYPDAプレート上で成長したコロニーからの候補レポーター株を特定する。同定されたコロニーを新しいYPDAプレートにストリークして単一コロニー分離株を得て、30度で2日間成長させる。望ましいP53応答エレメントの正しい集積をチェックし、ステップ1.20で述べた条件でPCR反応を行う。
PCR産物のアリコートをアガロースゲルにロードし、サンガーシーケンシング前に正しいアンプリコンの長さを確認します。プロトコル2は、定性的な色ベースのアデニン-2酵母アッセイを用いてP53タンパク質トランス活性化能を評価する方法の一例を提示する。第1項に記載の同じ酢酸リチウムベースのプロトコルに従うP53発現ベクターを用いて酵母細胞を変換する。
新しい選択的プレート上のプレートあたり最大6個の単一酵母変態コロニーを、30度で一晩成長させます。翌日、無菌ベルベットを使用して、色表現型、すなわちアデニンの制限量を含む選択的プレートの評価を可能にする新しい選択的プレート上のストリークをレプリカプレート。
3日間30度でインキュベートします。同じストリークをレプリカメッキを複数回行うことができます。プロトコル3は、定量発光ベースのLUC1酵母アッセイを用いたP53タンパク質トランス活性化能の評価の一例を提示する。
まず、P53発現ベクターを用いて酵母細胞を変換し、再度、第2項に記載の酢酸リチウムベースのプロトコルを用いた。グルコースを炭素源として含む新しい選択的プレート上の単一の形質転換体にパッチを当て、一晩で30度で成長させます。変換の種類ごとに、5 ~ 7 個の異なるパッチを作成します。
一晩増殖した後、炭素源としてラフィノースを含む合成選択的培地中に滅菌爪楊枝またはピペットチップを用いて少量の細胞を再懸濁する。これらの細胞懸濁液は、0.4の周りに600ナノメートルで光学密度を有し、異なる温度、治療でのインキュベーションのために複数の96ウェルプレートに分割することができ、またはP53発現を活性化するために様々な量のガラクトースに細胞を露出させることができる。ホタルレポーターの活動を測定するには、透明な96ウェルプレートから白い384ウェルプレートに10〜20マイクロリットルの細胞懸濁液を移し、細胞を同量のリシスバッファーと混合し、シェーカーの室温で10分、15分間インキュベートします。
ホタルルシファーゼ基板を10,20マイクロリットル加えます。マルチラベルプレートリーダーを使用して光単位を測定します。また、96ウェルプレートにおける培養物の光学濃度も測定する。
プロトコル4は、P53によって誘導される酵母の増殖の阻害を利用する方法の一例を提示する。P53発現ベクターを用いて酵母細胞を変換し、発現ベクターと共変換してP53およびその補因子の1つ(MDM2など)を、再び、セクション1に記載されている酢酸リチウムベースのプロトコルに従う。選択的培地で、約1つの光学密度に変換細胞を成長させます。
そして、0.05にそれらを希釈し、適切な濃度に選択した分子を追加します。シェーカーで細胞を30度で42時間インキュベートします。次いで、最小選択培地プレートでの酵母細胞培養の種子100マイクロリットル。
30度で2日間インキュベートします。ICOREカセットの代わりに正しいREインテグレーションは、候補酵母クローンからの微量の細胞から始まり、表3に記載されたプライマーを使用して標的遺伝子座を増幅するコロニーPCRによってチェックすることができます。PCR産物は、約500ヌクレオチドのバンドであり、その後、正しいP53応答要素配列の存在について編集されたゲノム位置の配列を確認するためにサンガーシーケンシングによって確認することができる。
レポーター株は機能アッセイで使用する準備ができています。P53タンパク質トランス活性化能を評価するには、酵母コロニーの色を確認してください。例えば、野生型P53と変異体R175HとR282Wの比較を、P21-5プライムとPUMAの2つの異なるレポーターと、30度と37度の2つの異なる温度を用いて提示する。
興味深いことに、R175Hは機能喪失P53アレーレであるが、R282Wは、すべての条件で、赤色コロニーは、30度の残留トランス活性化活性を有する温度感受性を示し、白いコロニーを生じるが、37度で活性を失い、赤またはピンクのコロニーをもたらす。拡張データセットは、4つの変異型対立遺伝子における図2B.Wild型P53で提示され、10種類のP53応答要素レポーター株、3つの温度、および構成的発現レベルを用いてトランス活性化について試験した。結果は、酵母コロニー色表現型を思い出させる色コードにまとめられる。
P53 K139E変異型アレーレは部分的な活性を保持し、冷感を持ちます。例えば、GADD45レポーター株では24度と30度のコロニーは赤色ですが、37度では白色です。ここでは、この方法で得られた結果の一例を示し、ヒトとC.elegans P53酵母のトランス活性化特異性を比較する。
棒グラフの結果は、4つの反復の標準誤差を持つ平均相対光単位として表されます。5つの異なるP53応答要素を比較した。P53タンパク質発現の3つの異なるレベルは、培地中のガラクトースの濃度を変化させることによって試験した。
2つのP53オルソログは、著しく異なるトランス活性化特異性を示しています。これは、28ヌクレオチドスペーサーの有無を除いて、同じ配列を共有するced13およびV1応答要素を有する結果によって例示される。ヒトP53はV1結合部位とのトランスアクティベーションの方がはるかに高く、C.elegans P53は反対を示す。
結果は、ガラクトース誘導性プロモーターの下でのP53発現のレベルから独立している。100マイクロリットルの培養液滴で得られたコロニー数を数えて酵母の増殖を測定する。野生型P53発現酵母の増殖を最大可能な効果として考慮した化合物の変異再活性化効果を計算し、変異体P53を発現する細胞の増殖がゼロレベルの再活性化を表す一方で100%に設定する。
この例では、Nutlin-3aはMDM2の共発現によって引き起こされる野生型P53の阻害を緩和し、一方、PhiKan083はY220C P53突然変異体を部分的に再活性化する。両方の場合において、これは、酵母の成長のP53依存的な減少をもたらす。酵母基底細胞は、P53タンパク質機能の値、側面を調査するのに有用であることが証明されています。
本研究で説明するプロトコルは、標的部位の変異体に対する野生型または癌関連変異体P53のトランス活性化電位を評価する場合に特に敏感である。さらに、P53機能に影響を与える小分子を同定し、補因子とのP53相互作用を研究するためにこのアプローチを使用することができる。カラーレポーターの使用により、ルシファーゼの小型化、ならびに成長抑制試験は、化学的ライブラリースクリーニングに潜在的に適した費用対効果の高いスケーラブルなアッセイをもたらす。
最後に、この研究で説明するシステムは、他の配列特異的転写因子の研究と容易に採用することができる。
