区画化された微小流体デバイスは、ニューロンを極偏の形で研究することを可能にする。これらのデバイスは、基本的な神経科学と翻訳神経科学の研究の両方に役立ちます。このプロトコルは、環状オレフィン共重合体チップを使用して、ヒト幹細胞から分化したニューロンを区分化する方法を説明する。
これらのCOCチップは、PDMSマルチコンパートメントデバイス上で分化されたニューロンのより健康的な培養を生成します。このプロトコルでは、NIH承認のH9幹細胞株と区別されるニューロンの培養を実証する。同様の手順を使用して、ニューロンをmIpSCsと区別することができます。
マルチコンパートメントチップは、加湿を加湿して二次封じ込めに配置する必要があります。マルチコンパートメントチップのチャネルは、プレコート溶液で満たされ、その後PBSでフラッシュする必要があります。まず、ポリL-オルニチンを細胞培養グレードの蒸留水に溶解し、チップあたり600マイクロリットルの溶液を作ります。
残りのPBSを井戸から吸引し、ピペット先端がチャネル開口部から離れているようにします。右上ウェルにポリL-オルニチンの作業溶液の150マイクロリットルをロードします。90秒待ってから、右下ウェルに150マイクロリットルの溶液を加えます。
5分間待ってから、左の井戸の溶液でローディングプロセスを繰り返します。その後、加湿器トレイにチップを入れて、一晩で摂氏4度にします。ペトリ皿を使用する場合は、パラフィルムで包み、一晩摂氏4度に置きます。
次に、ウェルから溶液を吸引し、ピペット先端がチャネル開口部から離れて配置されることを確認する。そして、滅菌水のそれぞれ150マイクロリットルで右と左の井戸を2回積み込んで繰り返します。ラミニン作業溶液を準備します。
ラミニン作業溶液のそれぞれ150マイクロリットルで右と左の井戸をロードします。トレイ内のチップを37°Cで2時間インキュベートします。カルシウムとマグネシウムを使わずにPBSでチップをすすぎ。
PBSのそれぞれ150マイクロリットルで右と左の井戸をロードします。5分間待ちます。井戸からPBSを吸引し、NSC培地でチップをすすいだ。
右と左の井戸にそれぞれ150マイクロリットルを積み込みます。チップをプレコンディショナーに5%CO2で37°Cインキュベーターでトレイに一晩インキュベートします。ヒト神経幹細胞をマルチコンパートメントチップに播種するには、まずヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を計る。
その後、井戸からメディアを吸引します。右上ウェルに細胞溶液のピペット5マイクロリットル、右下ウェルに5マイクロリットルが続く。顕微鏡を使用して、細胞がチャネルに入っていることを確認します。
細胞がチップの底に付着するまで5分間待ちます。ピペットは右および左の井戸にNSC媒体のおよそ150マイクロリットル。適当な加湿容器内の5%CO2、摂氏37度でインキュベート。
48時間後、井戸からNSC培地を吸引し、各上部ウェルと各底部ウェルに150マイクロリットルを加えることによって神経分化培地に置き換えます。5%CO2内の培養ニューロン、加湿器トレイ内の摂氏37度インキュベーター。軸索コンパートメントから残りの神経分化培地を取り出し、遠心分離管に入れます。
摂氏37度で保管してください。50マイクロリットルのウイルス溶液を150マイクロリットルの温めた媒体と混合する。ピペット100マイクロリットルの混合物を軸索コンパートメントの両方のウェルにする。
37°Cインキュベーター内で2時間インキュベート。ウイルス含有メディアを撤回し、廃棄する。1つの軸索コンパートメントによく新鮮なメディアの75マイクロリットルを穏やかにピペットし、メディアがチャネルを通って他の軸索井戸に流れ込みます。
このプロセスを 1 回繰り返します。最後に、保存した培地で軸索コンパートメントを充填し、チップをインキュベーターに移します。分化媒体を用いてチップで1週間後、ヒト神経幹細胞はニューロンに分化し、体性コンパートメント内に均等に分布して分布した。
これに対し、PDMSデバイスのニューロンは、分化培地の添加後早くも5日で凝集し、細胞の健康が損なわれた。mCherry蛍光タンパク質を用いた標識ニューロンおよび樹状脊椎の可視化は、チップ内で分化したNSC由来ニューロンが成熟したシナプスを形成することを示した。ニューロンは興奮性シナプスマーカー、vGlut1に対して標識された。
免疫染色結果は、ウイルス標識されたニューロンがvGlut1、およびニューロン特異的マーカーであるβ-チューブリン3と共局化できることを示している。ウイルス伝達されたmCherryニューロンは、予め組み立てられたチップ内に確立された軸索局在性微小環境に射影を拡張する。奇数の前と直後にmCherry標識ニューロンの画像間の比較は、完全に切断された軸索を示した。
アキソトミー手順を実行する場合を除き、チャネルが流体で満たされていることを確認することが重要です。COC区画化チップは使いやすく、神経損傷、シナプス形成、シナプス可塑性、疾患の病態生理学に関連する多数の調査への扉を開くことができます。
