ニューロンを区分化するために使用される微小流体デバイスは神経科学の標準的なツールとなっており、研究者はソマタ、軸索、樹状突起、シナプスを含むニューロンの細胞下領域を物理的および化学的に操作することができます。これらの区画化された培養装置は、シナプスを形成するために発達中に軸索がどのように伸びるか、シナプスが軸索損傷に続いてどのように改造および改革を行うか、およびアルツハイマー病のような疾患において病理学的状態がどのように同種的に伝播できるかなど、神経科学分野の多くの質問に答えるのに役立ちます。このプロトコルは、培養一次ラットニューロンを区分化するための組み立て済みプラスチックマルチコンパートメントチップの使用について説明する。
これらのチップを使用する主な利点は、ニューロンを区画化するための使いやすく、再現性の高い方法を提供することです。もう一つの利点は、これらのチップは、以前のシリコンベースの区画化されたデバイスよりも、ニューロンと単離軸索の健康的で長期的な成長をもたらし、高解像度顕微鏡と同等に互換性があることです。ヒト幹細胞を含む他のモデルシステムも、あらかじめ組み立てられた区画化チップ内で培養することができる。
まず、無菌のマルチコンパートメントチップをペトリ皿に入れます。チップの左上ウェルに100マイクロリットルのプリコーディング溶液を加え、メインチャネルを通って隣接するウェルに流れるようにします。次に、チップの左下ウェルを100マイクロリットルのプリコーディング溶液で満たします。
この時間は、マイクロ溝を通って溶液が流れるように5分待ちます。次に、100マイクロリットルのプリコーディング溶液を右上の井戸に加え、メインチャネルを通って隣接する井戸に流れるようにします。90秒後、右下に100マイクロリットルのプリコーディング溶液を充填し、チップを10分間インキュベートします。
慎重にピペットの先端を、メインチャネルから離れて角度を付け、各井戸から溶液を吸引します。その後、すぐに左上ウェルにPBSの150マイクロリットルを追加し、1.5分待ちます。次に、150マイクロリットルのPBSを左下ウェルに加え、5分間待って液体がマイクロ溝を流れるようにします。
その後、右上と右下の井戸にPBSの150マイクロリットルをその順序で追加します。10分後、再度PBSを吸引し、再度洗浄工程を繰り返す。2回目の洗浄に続いて、ピペット先端を釣ることによって、チャネル開口部から離れて、以前のように井戸からPBSを吸引する。
次に、1mil Poly-D-Lysine溶液あたり0.5ミックスの100マイクロリットルをチップの左上ウェルに加えます。1分半待ってから、ポリD-リジン溶液の100マイクロリットルで左下ウェルを満たします。このプロセスをチップの右半分で繰り返します。
ペトリ皿を閉じます。その後、チップを37°Cのインキュベーターに1時間置きます。インキュベーション後、前述のようにPBSでチップを2回リンスします。
次に、装置からPBSを吸引する。すぐに、チップの左上ウェルに100マイクロリットルの細胞培養培地を加えます。1分半後、左下ウェルにメディアを追加します。
マイクロ溝を通ってメディアが流れるように5分待ってから、チップの右側で充填プロセスを繰り返します。確立されたプロトコルに従って解き分けたラット海馬ニューロンの細胞懸濁液を準備する。チップの各ウェルの大部分のメディアを取り外しますが、チャンネルはいっぱいのままにしておきます。
次に、すぐに右上ウェルに細胞懸濁液の5マイクロリットルをロードし、右下ウェルで細胞懸濁液の別の5マイクロリットルをロードします。セルをロードする際は、ピペットの先端をメインチャンネルに向けます。細胞をロードした後、顕微鏡の段階にチップを移し、ニューロンがメインチャンネルに入っていることを確認します。
細胞が付着するまで5分待った後、右上と下右の各ウェルに約150マイクロリットルの神経培養培地を加えます。次に、上下左右のウェルに150マイクロリットルの培地を加えます。ペトリ皿を覆い、5%の二酸化炭素、摂氏37度のインキュベーターで加湿トレイにチップを入れます。
まず、軸索コンパートメントの左下ウェルから20マイクロリットルを取り出し、体性コンパートメントの右上のウェルに置きます。各チャネル内のフローが平衡化されるまで 2 分間待ちます。次に、軸索コンパートメントから50マイクロリットルの培地を取り出し、この培地に1ミリモルアレクサフルオール488ヒドラジドの0.3マイクロリットルを加えます。
ピペットを上下にして溶液を混合し、蛍光染料を含む培地を軸索コンパートメントに戻します。この時点で、必要に応じて、チップを顕微鏡と画像の上に置きます。チップ内でアキソトミーを行う場合は、まず、本軸コンパートメントから培地を取り出し、ピペットチップをメインチャネルの入り口から遠ざけます。
取り外したメディアは、今のところ遠心分離管に保管してください。次に、吸引ピペットを近くに置き、軸索コンパートメントのメインチャネルの入り口を完全に吸引する。1〜2分間、その地域の吸引を続けます。
軸索コンパートメントを保存されたメディアに交換します。溶液がコンパートメントから完全に取り除かれ、顕微鏡下でサンプルを見て軸索が切断されていることを確認してください。その後、チップをカバーし、インキュベーターに戻します。
蛍光免疫染色を開始するには、チップからほとんどの媒体を取り出し、内部コンパートメントを水分補給します。直ちに、軸索および体性コンパートメントの上部ウェルに100マイクロリットルの固定液を加えます。1分後、底部ウェルに100マイクロリットルの固定液を加え、室温で30分間細胞を固定します。
ウェルから溶液の大部分を取り除き、すぐに、軸索および体性コンパートメントの上部ウェルのそれぞれにPBSの150マイクロリットルを追加します。PBSが底の井戸に流れるまで2分間待ってから、PBSを取り除き、同じプロセスを使用して井戸をさらに2回すすます。最後のすすめに続いて、チップの井戸からPBSのほとんどを取り除き、すぐに、軸索および体性コンパートメントの上部ウェルのそれぞれに0.25%トリトンx-100でPBSの150マイクロリットルを追加します。
15分間待ってから、井戸から液体のほとんどを取り除きます。直ちに、軸索および体性コンパートメントの上部ウェルのそれぞれに150マイクロリットルのブロッキング溶液を加えます。15分後、ウェルから液体の大部分を取り出し、すぐに、軸索および体性コンパートメントの上部ウェルのそれぞれに100マイクロリットルの一次抗体溶液を加える。
チップを覆って蒸発を最小限に抑え、一次抗体の細胞を室温で1時間インキュベートします。次に、溶液の大部分を除去してチップをすすぐし、直ちに軸索およびセマティックコンパートメントの上部ウェルのそれぞれに150マイクロリットルのPBSを加える。5分後、両方の井戸からPBSを取り出し、さらに2回すすいでください。
さて、ウェルから液体のほとんどを取り除き、すぐに、軸索および体性コンパートメントの上の井戸のそれぞれに、PBSで2次抗体の100マイクロリットルを追加します。チップを覆って蒸発を最小限に抑え、室温で1時間インキュベートします。先に示したように、チップをPBSで3回リンスし、付随するテキストプロトコルに記載されているようにチップをマウントしてイメージ化します。
ここに示されているのは、プラスチックチップとPDMSデバイス上で成長したニューロンの並べて比較である。神経細胞の成長は、培養で最大15日までの2つのプラットフォーム内で同等であるが、より長い培養年齢では、プラスチックチップ内の孤立した軸索は、より少ない鼓動で健康的に見える。軸索コンパートメント内の軸索をさらに可視化するために、これらのサンプルはまた、培養中の22日間でプラスチックチップ内の健全な軸索成長を示すベータチューブリンIIIに対して免疫染色された。
さらに24日間のサンプルで染色すると、プラスチックチップで成長したニューロンが興奮性および阻害性シナプスマーカー、vGlut1およびvGatの両方を発現することを示す。ここでは、逆行標識mCherryニューロンと組み合わせた2つのシナプスマーカーがあります。軸索損傷および再生研究に対するこのチップの適合性を実証するために、逆行標識されたニューロンを奇抜化の前および24時間後に画像化した。
引き込み球と再生軸索は、いずれも奇抜化後に明らかです。これらの結果は、PDMS ベースのデバイスを使用してパブリッシュされたデータと同等です。従来のマルチコンパートメント チップは、長期間のニューロン培養を提供するニューロンを区分化するための使いやすいオプションを提供し、3 週間以上存続します。
この手順を試みる間, ニューロンの適切な数をシードし、培養中にインキュベーターが十分に加湿されていることを確認することを忘れないでください。.
