ミトコンドリアの機能不全は、多くの神経変性疾患の根底にあります。我々のプロトコルは、軸索のミトコンドリアダイナミクスを調べるための重要なツールを提供し、軸索変性を伴う神経疾患の研究を促進する。ミトコンドリア標識、生きた細胞イメージング、誘導多能性幹細胞技術を組み合わせることで、当社のプロトコルを使用して、ヒト軸索に沿ったミトコンドリア人身売買を特徴付け、その形態を解析することができます。
ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、これらの疾患を治療するための潜在的な治療標的を提供する神経変性疾患の幹細胞培養および動物モデルにおいて観察することができる。培養の35日目の後、ヒト誘発多能性幹細胞と分化した神経球を、摂氏37度で2分間、1mg/mlの細胞剥離液を有する小さなクラスターに解離する。インキュベーションの終わりに遠心分離によって細胞クラスターを収集し、NDMの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。
ポリオルニチンとラクトースデヒドロゲナーゼあたり100マイクロリットルの細胞の約5つのクラスターをプレートし、ウイルスフリーの成長因子基底膜マトリックスを上昇させ、35ミリメートルガラス底皿をコーティングした。次に、B27を添加したNDMの1ミリリットルを添加し、環状アデノシン一リン酸、インスリン様成長因子、ヒト脳由来神経栄養因子およびグリア細胞由来神経栄養因子を各培養に添加する。前脳ニューロンの軸索に沿ってミトコンドリアを視覚化するには、まずNDMで50ナノモル赤色蛍光色素を37°Cで3分間染色し、次いで暖かいNDMで2回の洗剤を行います。
次に、培養物を蛍光顕微鏡のステージに置き、40Xの目的を選択します。位相場下では、その形態学的特性に基づいて軸索を特定する。軸索に沿ったミトコンドリアの動きの方向を区別するために、ニューロンの細胞体を明確に識別する。
細胞体と軸索を区別した後、軸索中のミトコンドリアの露出時間と焦点を調整し、軸索内のミトコンドリア輸送を5秒ごとに合計5分間捕獲する。ImageJでミトコンドリア輸送を分析するには、フィジーを開き、バイオフォーマットプラグインを選択します。バイオフォーマットインポーターを使用して、tiffシリーズのタイムラプス画像をインポートし、標準のImageJを選択して、すべてのシリーズを開きます。
自動スケール分割チャンネルを確認し、[OK] をクリックして、ピクセル単位で画像のフレーム番号とサイズをメモします。60 フレームの明るさとコントラストを調整した後、セグメント化された線を使用して、セル本体から端子軸索に線を引きます。キモグラフを生成するには、複数のキモグラフプラグインを選択し、線幅を選択します。
移動ミトコンドリアオープンtsp050607の距離、時間値および速度を測定する。マクロプラグインの txt。そして、上位から劣った領域に上からキモグラフ上のミトコンドリアの動きの痕跡の上にセグメント線を描きます。
線を描画した後、マクロプラグインのtspから読み取り速度を開き、線に対応するセグメント化された速度を読み取ります。次に、元のイメージを開き、線ツールを使用して、スケール バーに沿って線を描画します。線の長さを測定し、dx と距離の単位をピクセルからマイクロメートルに変換するには、[解析]を選択します。
次に、時間をピクセルから秒に変更します。ImageJで軸索内のミトコンドリアの長さと面積を分析するには、ストレートアンダースコアドットJARプラグインをインストールし、対象の軸索画像を開きます。32 ビットイメージを 8 ビットに変換し、セグメント化された線ツールを使用して軸索をトレースします。
ストレートアンダースコアJARプラグインを選択し、フィラメント幅の幅を50ピクセルに設定します。軸索を再度トレースして、まっすぐな軸索を生成し、画像のしきい値を調整します。測定を設定するには、境界の測定を選択して楕円とシェイプ記述子を設定し、線関数を使用して元のイメージのスケール バーを測定します( を参照)。
[分析とスケールを設定するには、ピクセルの既知の距離とスケールを設定する長さの単位を入力します。次に、[グローバル] を選択して、すべてのイメージにスケール設定を設定します。最後に、分析と分析のパーティクルを選択して領域を決定し、結果の測定結果を表示する結果を選択します。
テレンスファリックグルタミン酸細胞への分化後、細胞は、それらのT-B-R1およびβ3個のチューブリンマーカー発現によって特徴づけることができる。赤色蛍光色素とタイムラプスイメージングによる染色により、ミトコンドリアの軸索輸送の評価が可能です。単一のミトコンドリアは、静電気を保つことができるか、軸索内の進続方向または逆行方向に移動することができます。
軸索に沿ったミトコンドリア運動の速度は、図示のように定量化することができる。例えば市販の分析ソフトウェアを用い、野生型ニューロンと比較してS-P-G-3-Aニューロンにおいて、モチルミトコンドリアの割合が有意に低下する。ミトコンドリア領域長さおよびアスペクト比軸索を解析するために、画像解析ソフトウェアで矯正し、閾値を調整して選択することができる。
ミトコンドリア面積の周囲長さ幅とアスペクト比は、その後、まっすぐな軸索から得ることができます。例えばミトコンドリア長とアスペクト比の両方が、野生型軸索を制御するのと比較してS-P-G15ニューロン軸索において有意に減少する。培地と顕微鏡インキュベーターを温めて細胞を優しく洗い、細胞がイメージング前に20分間安定するようにすることが重要です。
生細胞イメージング後、培養物を固定し、免疫染色を行い、目的の他のタンパク質の発現を調べることができる。生きている人間の神経のミトコンドリアダイナミクスを調べることは困難です。この技術は、神経疾患におけるミトコンドリアダイナミクスおよび神経変性の研究のためのユニークなツールを提供します。
