最近の研究は、肥満の発症時に脂肪組織リモデリングにおける血管新生および交感神経革新の重要な役割を強調している。ここでは、脂肪組織に血管や神経線維を効率よく置く免疫蛍光法の改変を実証する。当社のアプローチは、立ち上がり効率と品質に妥協なく、簡単かつ効率的です。
共焦点顕微鏡を用いて画像を取得します。画像の高解像度により、血管ネットワークを再構築し、その特性を正確に分析することができます。6週間C57 Black-6J雄マウスの麻酔と灌流で、この手順を開始します。
マウスから白と茶色の脂肪の問題を解剖します。はさみを使用して、組織サンプルを小さな塊に分割します。滅菌されたピンセットで小さな塊をカセットの組織サンプルの適切な標識とカセットの組織埋め込みカセットに移す。
組織サンプルを含む埋め込みカセットを摂氏4度で24~48時間浸漬します。小さな塊をペトリ皿に殺菌したピンセットを移す。1回の洗浄で0.5ミリリットルでブラシ1xPBSバッファーでサンプルを3回洗浄します。
次に、固定組織サンプルを滅菌したはさみで約2立方ミリメートルキューブに切ります。パーメアバリゼーションの場合、サンプルを1%トリトンPBSバッファーの1ミリリットルを含む1.5ミリリットルのチューブに移し、室温で18 RPMで1時間静かに回転させます。1時間後に1%のトリトンPBSバッファーを慎重に除去し、同じチューブに直接1x PBSを加えてサンプルを3回洗浄します。
各洗浄中に、チューブを数回反転します。ブロッキングの場合は、0.5ミリリットルのブロッキングバッファーをサンプルに加え、室温で緩やかな回転で2時間インキュベーターを加えます。一次抗体溶液の0.4ミリリットルを調製するには、抗エンオブスチンの2マイクロリットルと396マイクロリットルのブロッキングバッファーまで抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体の2マイクロリットルを希釈します。
渦とスピンダウンしてボリュームを回復します。さて、慎重に組織の塊からブロッキングバッファーを除去します。調製した一次抗体溶液の100マイクロリットルをチューブに加え、一晩で4度の摂氏でインキュベートします。
翌日、必要に応じて再使用のために一次抗体溶液を慎重に回収する。18 RPMで穏やかな回転で30分間、1回の洗浄あたり500マイクロリットルで1x PBSTでサンプルを3回洗浄します。二次抗体溶液の調製のために、2マイクロリットルの小麦粉を共役させた抗神IGGを2マイクロリットルの小麦粉製小麦粉共役抗狂犬病IGGを396マイクロリットルのブロッキングバッファーに希釈する。
渦と回転を短時間で回して、すべての液体を集める。次に、サンプルから最後の洗浄バッファーを取り外します。チューブに100マイクロリットルの二次抗体溶液を加えます。
18 RPMで穏やかな回転で2時間室温でサンプルをインキュベートします。二次抗体溶液を慎重に除去した後、1回の洗浄あたり500マイクロリットルで1x PBSTでサンプルを3回洗浄し、それぞれ18RPMで穏やかな回転で30分間洗浄します。光学的クリアランスの場合は、サンプルを90%グリセロールの1ミリリットルに浸し、透明になるまで暗闇の中で4度の摂氏にサンプルを保ちます。
スライドにシリコンアイソレータを追加して、ボリュームイメージング用のウェルを作成します。シリコーンの高さをサンプルの高さよりわずかに小さく保ちます。慎重に井戸にサンプルを転送し、取り付け媒体でそれを埋めます。
表面にカバースリップを置き、高粘度媒体でカバースリップの四分の一を密封します。取り付け媒体は室温と暗闇で24時間硬化させます。硬化が完了したら、カバースリップの端を完全に密封して、最適なサンプル長寿を実現します。
共焦点顕微鏡とその対応するソフトウェアの20倍の目的でZスタック画像を取得します。システムを起動します。構成タブをクリックし、アルゴンレーザーとHe-Ne 633レーザーの両方をアクティブにします。
取得タブをクリックします。可視レーザーラインパネルで、対応する強度スライダーを上に動かして、488ナノメートルと633ナノメートルまでのレーザーラインを選択します。最初の強度は、20〜30%に設定することができ、今488、561、633トリプル二色ミラーを選択します。
アクティブなチェックボックスをクリックして、写真の乗数を有効にします。633ナノメートルレーザーの場合は、488ナノメートルレーザーと光増倍光器34によって加えられる発光のための光倍数計を選択してください。フォトマルチプライヤーの波長範囲を 500 ~ 550 ナノメートルに設定します。
650〜750ナノメートルで、フォトマルチプライヤー3用。画像表示に使用する擬似色を選択するには、各写真の乗数の横にある色付きの長方形をダブルクリックし、ポップアップメニューから色を選択します。今すぐライブをクリックして、サンプルで画像を確認します。
Z 位置ノブを使用して、対象となる XY 領域内のフォーカス平面を選択します。レーザーの輝度、スマートゲイン、オフセットを回して、画像の明るさを調整します。各蛍光チャネルについて、クイックルックアップテーブル表示モードでこの調整を行います。
テーブルのクイック ルックアップ ボタンをクリックして、飽和ピクセルが青色で表示されるクイック ルックアップ テーブル モードに入り、適切な明るさレベルの設定を支援します。[クイック検索テーブル] ボタンを 2 回クリックすると、擬似カラー表示モードに戻ります。スキャン中に、Z位置ノブを反時計回りに回して、フォーカスの平面を目的のボリュームの一方の端に移動します。
次に、矢印の矢印をクリックしてスキャンと位置を設定します。目的のボリュームのもう一方の端に、試料を通してフォーカス平面を移動するには、時計回りの Z 位置ノブを回します。次に、開始矢印をクリックして、スキャン開始位置を設定します。
Z ステップサイズを 3 ミクロンに調整します。1024 x 1024 の形式、100 Hz の A 速度、および 2 のライン平均を選択して、画質を変更します。[Z スタック イメージの取得開始を開始する開始] 取得したイメージ スタックの最大投影を開始するには、[プロセス] タブをクリックし、[ツール] をクリックし、[3D 投影] を選択し、X、Y、Z.Set しきい値を 0 に変更せずにメソッド リストに最大値を入力し、適用をクリックします。
Z ボリュームの最大強度は、表示される 2D イメージに積み重ねられます。オープンソースソフトウェアを介して2D画像を分析するには、ソフトウェアで積み重ねられた画像を開きます。すべての容器構造が適切に選択されるまで、容器の直径と強度を調整します。
[実行分析] を選択し、ソフトウェアのガイダンスに従ってデータをエクスポートします。ライセンスソフトウェアを介して3D画像を分析するには、ソフトウェアで画像の生データを開きます。Z体積の各層の容器構造が適切にセグメント化されるまで、強度しきい値やその他のパラメータを調整します。
結果として生じる二項生成イメージ スタックをスケルトン化して、特別なグラフを取得します。選択したセグメントの特性を分析し、ソフトウェアのガイダンスに従ってデータをエクスポートします。遠位領域上端上体白色脂肪組織、肩腰椎皮下白脂肪組織及び肩甲内褐色脂肪組織の内側領域の内側領域を採取した。
全体のマウント染色後、組織のトランクを取り付け、共焦点顕微鏡で画像化した。より多くの血管が積極的に染色された。グリセロール中の抗エンドムシン抗体を皮下白脂肪組織にインキュベートすると、血管の完全な染色に対してクリアステップが重要であることを示唆している。
この方法で血管と神経線維がデポ間で異なるパターンを示すかどうかを判断するために、共同蛍光染色を抗エンオブシン抗体を有する脂肪組織で血管を示し、抗チロシンヒドロキシレーゼで神経線維を示した。興味深いことに、結果は、白い脂肪組織と比較して、茶色の脂肪組織の神経線維よりも有意に多くの血管であったことを示している。白色脂肪組織の中でも、皮下白脂肪組織は、上端体白色脂肪組織よりも高い血管密度を示した。
注意すべきは、神経線維は血管と並行して拡大したが、有意な共局在化を示さなかった。血管面積、接合部数、チューブ長さを、これら3種類の脂肪組織における2D法で定性的に測定し、同様の結果を見いだした。この方法は、効率的にcos-dens血管および神経線維および脂肪組織を含む。
これは、肥満の開発中に脂肪組織の動的変化を研究するための有用なツールとして聞こえます。強力な口ハイドは有毒です。より広い皮膚接触と吸入にP-ifa関与ステップを行い、レーザービームが焦点顕微鏡になっても目に害を与えているため、P-ifaを適切に処理してください。
目的から来るビームへの目の露出を避け、
