超複合体は、内ミトコンドリア膜における呼吸鎖複合体によって形成される超分子集合体である。これらの超複合体の形成は、活性酸素種の産生減少、個々の呼吸鎖複合体の安定化およびより効果的な組立、呼吸鎖活性調節、および内膜のタンパク質豊富な環境におけるタンパク質凝集の予防を含むいくつかの構造的および機能的利点を与えると考えられている。超複合体の組立および組成の変化は動的であり、生理学的適応中に観察されたミトコンドリア機能の変化、ならびに様々な遺伝的および獲得した疾患の根源的な点がますます示されている。
このビデオでは、ハイブリッドクリア/ブルーネイティブPAGEプロトコルを、超複雑化を正確かつ時間効率の高い方法で解決および分析します。このハイブリッドクリア/ブルーネイティブPAGE法の主な利点は、伝統的な青色およびクリアネイティブPAGEプロトコルのさまざまな側面を最適に組み合わせることであり、公開されたプロトコルと比較して洗剤やアニオン性化合物への暴露を最小限に抑えることができます。超複合体の最適な分離と分析は、大きな勾配ゲルで達成されます。
この手順には、手作業のスキルと慎重な実行を必要とするいくつかの繊細な手順が含まれます。書かれたプロトコルへの視覚的なサポートは、技術の実装を容易にする重要なヒントを提供します。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、アレクサンドリアです。
まず、ミトコンドリアを動物組織から1.5ミリリットル管で1.5ミリリットル管で分離して摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を捨て、デジコニンを含む氷冷抽出バッファーの計算された体積をチューブに加えてミトコンドリアペレットを再懸濁します。チューブをミニチューブ回転器に置き、中回転速度で摂氏4度で30分間インキュベートします。
20、400回-Gで遠心分離機サンプルを摂氏4度で45分間、可溶化した断片を除去する。上清を氷上の新しいチューブに移します。同じ日に電気泳動が行われない場合は、サンプルをマイナス80°Cで保存してください。
鋳造室を開きます。チャンバーに20センチメートルの22センチメートルの外ガラス板を置きます。アライメントカードを使用して1セットの1セットを配置し、チャンバーの側面と角にしっかりと固定されていることを確認します。
スペーサーの上に内側のガラス板を置いてゲルサンドイッチを形成し、ガラス板の上にプラスチック分離シートを置きます。さらに3つのゲルサンドイッチアセンブリを配置します。部屋の残りのスペースを取るために必要な場合は、より多くのアクリルブロックやガラスプレートを追加します。
ガスケットをガスケットノッチにしっかりと取り付け、溝にパラフィルムを入れ。天井プレートをチャンバーに置き、6本のネジをすべて締めます。鋳造室に立ちます。
光混合チャンバーに磁気スターラーを備えた攪拌板にグラディエントフォーマーを配置します。鋳造室のチューブを勾配前体に接続し、蠕動ポンプのカセットにチューブを固定します。前者の勾配のストップコックが閉じられていることを確認します。
4つのゲルをキャストするには、2つのエルレンマイヤーフラスコに4%の60ミリリットルと12%ゲル溶液の60ミリリットルを調製し、完全に回して混合する。4%ゲル溶液を軽い混合チャンバーに注ぎ、12%を勾配前体の重いリザーバーチャンバーに注ぎます。攪拌板の攪拌速度を350rpmに設定する。
その後、ストップコックを開き、35 rpmでポンプをオンにします。軽い分率の溶液レベルが重い分画より低い場合は、ポンプを一時停止し、軽い貯水池と重い貯留層の間で弁幹を開きます。分数のボリュームが平衡化し、ポンプを再起動してみましょう。
気泡がシステムに入り込み、ガラス板の間に閉じ込められないようにしてください。勾配ゲルが完全に注がれたら、ポンプを停止し、ゲルの乾燥を防ぐために、各ゲルサンドイッチに1ミリリットルの水を重ねます。2時間重合させてください。
25ミリリットルの積み重ねゲルをエルレンマイヤーフラスコに準備し、十分に混ぜるために渦巻きます。モンタージュを繊細に反転して水を取り除き、各ゲルサンドイッチに15ウェルの櫛を挿入します。積み重ねゲルを注ぎ、2時間重合させます。
その後、ジェルとサンドイッチクランプを挿入し、櫛を取り外します。短いガラス板を下に向けて、冷却コアにゲルサンドイッチを挿入します。反対側で繰り返し、電気泳動タンクにコアを置きます。
電気泳動タンクの内側のチャンバーに300ミリリットルの青いカソードバッファーを注ぎます。ピペットと負荷の先端で、井戸あたり75〜175マイクログラムのタンパク質をロードします。冷たい部屋で4°Cで、電極を電源に差し込んで150ボルトにして、1時間半、またはサンプルがすべて勾配ゲルに入るまでゲルを実行します。
サンプルを別々のウェルに反復して、OXPHOS複合体のインゲル活性とイムノブロット分析の並列判定を可能にする。ピペットで青いカソードバッファーを取り除く。300ミリリットルのクマシーブルーフリーカソードバッファーで交換し、冷たい部屋で一晩200ボルトでゲルを実行します。
電気泳動が終わる前に、原稿に従ってインゲル活性バッファーを調製し、室温で暗闇の中に保管してください。電気泳動を停止し、ゲルを取り出します。ビニール袋を切って本のように開けることができるようにします。
車線をカットし、ゲルレーンをビニール袋に移します。ヒートシーラーを使用して、3つの側面のうちの2つをシールします。陰性対照実験が行われた場合、アッセイバッファーに阻害剤を追加します。
3つの実験サンプルに対して、20ミリリットルのインゲル活性バッファーを加える。泡を取り除き、ビニール袋の4番目の側面を密封します。暗闇の中で摂氏37度でゲルレーンをインキュベートし、15分ごとにチェックします。
インキュベーション時間は、タンパク質および複合体の量によって異なります。インキュベーション後、反応を止めるために水中のゲルレーンを水に流す、および複素子の白い背景上の画像、複素II、複素IV、または黒色の背景の複雑なV.この例では、複雑なIVインゲル活性を行い、新鮮なマウス肝臓ミトコンドリアから分離した超複合体を可視化した。このサンプルの最適なデジコニン量は、単量体複合体IVと高分子量超錯体の良い解像度を提供するため、グラム当たり4グラムです。
より低い比率では、バンドは電気泳動中に明確ではなく、スミアに分解され、デジトニンの比率が高いと高分子量超錯体の破壊につながります。1つのマウスから分離された肝臓ミトコンドリアを、呼吸超複合体を抽出するために最適な量のデジコニンで治療した。OXPHOS複合体の電気泳動移動度は、タンパク質をハイブリッドクリア/ブルーネイティブPAGE条件を使用して分離すると、標準的なネイティブPAGEと比較して、クーマシーブルーの量が減少するため、わずかに減少します。
この移動性シフトは、複雑なIVモノマーに続いて複雑なVモノマーに大きく、複雑なI.青色の背景は、青色ネイティブPAGEと比較して、ハイブリッドクリアネイティブ/ブルーネイティブPAGEでは低い。青色のネイティブPAGEに続く高い背景レベルは、複雑なIIのインゲル活性染色を完全にマスクし、複雑なIVダイマーの活性に関連するバックグラウンドノイズを増強します。このプロトコルでは、酵素活性と生理学的タンパク質相互作用を維持しながら、最適な可溶化を可能にする条件を特定するために、目的のサンプルを様々な量のデジコニンで滴定することが重要です。
ゲル鋳造に関するすべてのステップは、適切なサンプル分離のために最適な勾配の形成に細心の注意を払って行われるべきである。これらの大きく壊れやすいゲルの操作についても細心の注意を払う必要があります。常にゲルの高いパーセンテージの端を使用して、いくつかの指でそれらを保持します。
このハイブリッドクリア/ブルーネイティブPAGE法では、サンプルは他の洗剤に曝露することなく、電気泳動の開始時にアニオン性色素クマシーブルーに短時間しか露出しません。これにより、従来の青色ネイティブPAGE法と同様に、超複合体を効果的に分離して解決することができ、超複合体内のゲル内活性アッセイおよび不安定タンパク質相互作用に対する高いクマシーブルーレベルの悪影響を回避できます。このプロトコルを使用すると、精密かつ迅速なインゲル活性測定と、2D電気泳動、免疫検出、および/またはプロテオミクスによる超錯体の分析を含む分析技術を組み合わせることが可能です。
