この組換えスパイダーシルクの可溶化方法は、従来の過酷な有機溶剤では不可能な材料形態を作り出します。また、このプロセスは、穀物であり、水中での単純なタンパク質溶液をもたらす。この方法を利用することにより、形成または製造された材料は、スパイダーシルクタンパク質の望ましい特性を維持する。
組換えスパイダーシルクのためのこの可溶化技術は、組み換えクモ糸の一段階のプロセスでの可溶化を可能にする。これらは、タンパク質を生成することが困難で、広範な処理によって失われるので、これは望ましいです。さらに、溶液は水中のタンパク質にすぎないので、その用途に望ましい場合は、他の生物学的に活性な化合物を添加することができる。
特に、タンパク質構造機能関係は、このシステムは、クモが高濃度で水やタンパク質を利用するという面で繊維を作る方法に対するメメティックである。この可溶化法とその後の材料形成を用いることで、形成される材料と、その原因となる構造を理解することが可能になるはずです。アルカリ性または酸性環境を溶媒和物に必要とする合成ペプチドを可溶化するためにこの技術を使用したと考えられています。
すなわち、これらのペプチドに対する下流用途において有利である可能性がある。さらに、合成的に発現すると多くの既知のタンパク質が不溶性分画に終わる傾向がある。再溶解し、これらのタンパク質を再折り畳むのは、多くの場合、大きな損失をもたらす骨の折れるプロセスです。
この技術を利用することで、不溶性タンパク質の回収プロセスの効率を高めることができる可能性がある。電子レンジに密封されたバイアルを置くことは、過熱し、バイアルを加圧するリスクを与える少し困難です。熱と圧力を加えるために段階的なアプローチを理解することは非常に重要です。
第二に、特に組換えクモ糸については、塩が存在する場合、塩の量に応じて効果的に働いたり働いたりする技術を許さない。塩の除去が鍵です。忍耐強く、注意して、あなたのマイクロ波の時間とバイアル内の温度を注意深く監視します。
従来の書かれた資料や方法のセクションを通して伝えることがしばしば困難である動作する可動部品の数があるので、それは重要です。適切な研究を妨げる溶解性の問題を抱えるタンパク質が多く存在することを考えると、この方法は、様々なタンパク質空間に適用して改善したり、分析技術や特性評価を可能にしたりする可能性があります。まず、ゴム製のネジキャップを備えたクリーンで新しい8ミリリットルオートクレーブ可能なホウケイ酸ガラス培養バイアルを選択し、空のバイアルを分析バランスに置きます。
空のバイアルの質量を引き裂き、バランスがゼロ質量を読み取るようにします。目的の凍結乾燥した組み換えスパイダーシルクタンパク質粉末を特定の材料の空のバイアルに加えます。次いで、所望の量の超純水を、少なくとも2ミリリットル、バイアルに加える。
バイアルキャップをシールし、内容物を活発に渦を出して、分散した均質な組換えクモ糸タンパク質混合物を作成する。バイアルキャップの最終チェックを行い、しっかりとしっかりと締め付けされていることを確認します。次いで、700〜1500ワットの電力範囲を有する従来の電子レンジに懸濁した組換えクモ糸タンパク質混合物を移す。
手動でオン/オフを切り替えることで、5秒のバーストがフルパワーでマイクロ波の動作を開始します。各バーストの後、ドアを短時間開き、慎重に沈降を防ぐためにバイアルを混合し、懸濁液を維持します。時折、バイアルと溶液を冷却させ、過熱溶液がシールに触れるのを防ぎます。
赤外線温度計を使用して、バイアルの一部を含む溶液の温度を測定します。温度が最低130°Cに達し、固体微粒子がすべて完全に溶解するまで、マイクロ波プロセスを繰り返します。その後、溶液の温度とバイアルキャップを摂氏100度以下に冷却します。
この溶液が完全に冷却される前に、バイアルから特定の幾何学に鋳造して、ヒドロゲルを形成します。ヒドロゲルが形成されたら、水浴に入れ、マイナス20度で冷凍庫に移します。お風呂が完全に凍るまで待ちます。
冷凍庫から凍結ヒドロゲルと水浴を取り除き、摂氏25度で解凍することにより、スポンジ形成プロセスを完了します。その後、解凍した水から得られたスポンジを取り除きます。ライオゲルを調製するには、凍結したヒドロゲルサンプルを凍結乾燥剤に移します。
24時間後、最終凍結乾燥ゲル材料を容器から取り出す。組換えスパイダーシルクタンパク質のフィルムを製造するために、200マイクロリットルのホット可溶化された組換え糸タンパク質をバイアルから所望の形状のPDMS形態にキャストする。乾燥後、テストまたは治療のためにPDMS基板を剥がします。
基材から除去できないコーティングを準備するには、エアブラシ噴霧器を使用して可溶化された組み換えスパイダーシルクタンパク質を適用し、選択した基質に初期スプレーコーティングを施します。乾燥後、被覆された基材を可溶化した組換え糸タンパク質に沈水させて、ディップコーティングを形成する。ディップコーティングを繰り返して、所望の厚さを達成します。
接着剤を形成するには、ピペットを使用して可溶化された組換えスパイダーシルクタンパク質を基質に加え、溶液の上部に第2の基質を塗布する。しっかりとピースをクランプし、少なくとも16時間摂氏25度の最小限の温度でオーブンでサンプルを乾燥させます。ウェットスピン繊維を生成するには、19ゲージのグライドニードルを使用し、可溶化したドープ溶液をLuerロックチップで同心円のシリンジにロードします。
気泡を排出し、ドープはシリンジのルアーロック端に座らせます。16インチ以上の外径の1つのためのPEEKチューブのワンピースフィンガータイトなフィッティングに少なくとも25ミリメートルのPEEKチューブを挿入し、10オーバー32櫛。19ゲージの針を、シリンジのLuerロックメスアダプタのこのセットアップに交換してください。
次に、中間ゴデの外側にニトリル手袋を置き、繊維が滑り落ちないようにし、モーターに損傷を与えないようにします。凝固浴として使用するために99%純粋なイソプロパノールと背の高い透明なガラス浴を取得します。イソプロパノールと蒸留水の80〜20の比率で最初のストレッチバスを充填します。
第2のストレッチ浴で、イソプロパノールと蒸留水の20〜80の比率を満たす。コンピュータ上のゴデットストレッチシステムを設定します。ファイバー除去の主速度を調整するには、繊維の形成速度と速さによって、ゴデット・トリプレット A 速度のスライド・バーを 1 秒あたり 10 ~ 14 ミリメートルの値に調整します。
ゴデットトリプルBストレッチ比のスライドバーを2つに移動して最初のストレッチを開始ストレッチバス1の最終ゴデット、中央上のゴデット、ストレッチバス2の最初のゴデット。2番目のストレッチを開始するには、ゴッドトリプルCストレッチ比のスライドバーをストレッチバス2、最後の上のゴデット、およびワインダーの最終ゴデットの2に移動します。このセットアップは凝固浴の後の最初のゴデット、そして最初のストレッチバスの最初のゴデットが同じ速度で回転していることを保障する。
次に、カスタムスピンライン機器の注射器にシルク溶液をロードします。自動化システムでは、イソプロパノールで満たされたガラス凝固浴にシルク溶液を押し出すために、1秒あたり10ミリメートルに押し出し速度を設定します。薄い金属フックで繊維を風呂から引き出す前に、繊維の押出しが均一になるようにします。
お風呂から繊維を取り外して、PEEKチューブチップと、バースから出る繊維の経路の間にループが生じることを確認します。一連のゴダを通して取得した繊維を導き、繊維はストレッチバスに沈むが、ストレッチバスの間の空気中で乾燥し、スプールに入る前に。このプロトコルでは、組換えクモ糸タンパク質の可溶化を通じて、様々な材料形態を達成することができる。
ここでは、7つの材料形式を紹介します。ヒドロゲル、リオゲル、スポンジ、接着剤、コーティング、フィルム、繊維。繊維は凝固浴に押し出すことによって最も広範な処理を要求し、次にポストビン伸縮浴で生繊維を連続的に伸ばす。
タンパク質および水溶液が比較的高温および圧力に加熱されることを考えると、我々の経験は、タンパク質が溶媒和された時点で溶液が無菌であるということであった。これにより、ここで提示される材料形態のいずれかを細胞培養に持ち込み、適切に取り扱う限り、材料に対する細胞応答を研究することができます。確かにこの技術は、接着剤やスポンジ材料を含む新しい材料形態の発見につながっています。
繊維形成に向けて必ずしも向いているわけではない材料形態は、繊維形成もこの技術の開発を通じて改善を見た分野の一つである。密閉されたバイアルの内部に熱と圧力を発生させることは、固有の危険を持っています。これらの手順を実行する際には、必ず個人用保護具を着用してください。
