Diese Methode der Löslichkeit rekombinanter Spinnenseiden produziert Materialformen, die mit traditionellen harten organischen Lösungsmitteln nicht möglich sind. Darüber hinaus ist der Prozess Getreide, was zu einer einfachen Proteinlösung in Wasser führt. Durch die Verwendung dieser Methode erhalten die gebildeten oder hergestellten Materialien die wünschenswerten Eigenschaften von Spinnenseidenproteinen.
Diese Löslichkeitstechnik für rekombinante Spinnenseiden ermöglicht die Löslichkeit rekombinanter Spinnenseiden in einem einstufigen Prozess. Dies ist wünschenswert, weil diese notorisch schwierigen Proteine nicht durch umfangreiche Verarbeitung verloren gehen. Da die Lösungen nur Protein in Wasser sind, können andere biologisch aktive Verbindungen hinzugefügt werden, wenn dies für die Anwendung wünschenswert ist.
Insbesondere die Proteinstruktur-Funktionsbeziehung, dieses System ist memetische, wie eine Spinne eine Faser macht, indem sie Wasser und Proteine in einer hohen Konzentration nutzt. Durch die Verwendung dieser Löslichkeitsmethode und einer anschließenden Materialbildung sollte es möglich sein, Verständnis für die gebildeten Materialien und die strukturen, die für sie verantwortlich sind, zu gewinnen. Es wird angenommen, dass es sein kann, Wir haben diese Technik für die Löslichkeit synthetischer Peptide verwendet, die sonst eine alkalische oder saure Umgebung benötigen würden, um zu solvate.
Das kann bei nachgelagerten Anwendungen für diese Peptide von Vorteil sein. Darüber hinaus neigen eine Reihe bekannter Proteine, wenn sie synthetisch exprimiert werden, dazu, in der unlöslichen Fraktion zu enden. Resolubilisieren, und dann diese Proteine neu falten ist oft ein mühsamer Prozess, der zu großen Verlusten führt.
Durch die Verwendung dieser Technik könnte es möglich sein, die Effizienz von Rückgewinnungsprozessen für unlösliche Proteine zu erhöhen. Das Platzieren einer versiegelten Durchstechflasche in eine Mikrowelle ist etwas beängstigend, was das Risiko einer Überhitzung und damit über das Druckaufdrücken der Durchstechflasche gibt. Das Verständnis des inszenierten Ansatzes zur Anwendung von Wärme und Druck ist von entscheidender Bedeutung.
Zweitens, für die rekombinante Spinnenseide insbesondere, mit Salz vorhanden wird nicht zulassen, dass die Technik arbeiten oder arbeiten so effektiv, je nachdem, wie viel Salz vorhanden ist. Salzentfernung ist der Schlüssel. Seien Sie geduldig und vorsichtig, überwachen Sie Ihre Mikrowellenzeiten und -temperaturen in der Durchstechflasche genau.
Es ist entscheidend, da es eine Reihe von beweglichen Teilen gibt, die oft schwierig durch herkömmliche schriftliche Materialien und Methodenabschnitte zu transportieren sind. Angesichts der Tatsache, dass es viele Proteine gibt, die Löslichkeitsprobleme haben, die eine angemessene Untersuchung verhindern, hat diese Methode das Potenzial, über eine Vielzahl von Proteinräumen angewendet zu werden, um sich zu verbessern, oder sogar analytische Techniken und Charakterisierung zu ermöglichen. Wählen Sie zunächst eine saubere und neue acht Milliliter autoklavierbare Borosilikatglaskultur-Durchstechflasche mit einem gummigefütterten Schraubverschluss aus und legen Sie die leere Durchstechflasche auf eine analytische Waage.
Reißen Sie die Masse der leeren Durchstechflasche, so dass die Waage NullMasse liest. Fügen Sie das gewünschte lyophilisierte rekombinante Spinnenseidenproteinpulver in die leere Durchstechflasche für das jeweilige Material ein. Dann fügen Sie die gewünschte Menge an ultrareinem Wasser, mindestens zwei Milliliter, in die Durchstechflasche.
Versiegeln Sie die Durchstechflasche und wirbeln Sie den Inhalt schnell aus, um eine dispergierte und homogene rekombinante Spinnenseide-Protein-Mischung zu schaffen. Führen Sie eine abschließende Überprüfung der Durchstechflasche durch, um sicherzustellen, dass sie fest und sicher angezogen wurde. Dann übertragen Sie die schwebende rekombinante Spinnenseidenproteinmischung in einen herkömmlichen Mikrowellenherd mit einem Leistungsbereich von 700 bis 1500 Watt.
Beginnen Sie den Betrieb der Mikrowelle mit fünf Sekunden Bursts, die volle Leistung durch manuelles Ein- und Ausschalten einstellen. Nach jedem Platzen kurz die Tür öffnen und die Durchstechflasche vorsichtig mischen, um eine Setzung zu verhindern, und halten Sie die aufgehängte Mischung. Gelegentlich die Durchstechflasche und die Lösung abkühlen lassen und verhindern, dass die überhitzte Lösung die Dichtung berührt.
Verwenden Sie ein Infrarot-Thermometer, um die Temperatur der Lösung zu messen, die einen Teil der Durchstechflasche enthält. Wiederholen Sie den Mikrowellenprozess, bis die Temperatur mindestens 130 Grad Celsius erreicht und alle festen Partikel vollständig aufgelöst wurden. Dann lassen Sie die Temperatur der Lösung und die Durchstechflasche Kappe unter 100 Grad Celsius abkühlen.
Bevor diese Lösung vollständig gekühlt wird, gießen Sie sie aus der Durchstechflasche in spezifische Geometrien, um ein Hydrogel zu bilden. Nachdem das Hydrogel gebildet ist, legen Sie es in ein Wasserbad und übertragen Sie es bei minus 20 Grad Celsius in den Gefrierschrank. Warten Sie, bis das Bad vollständig gefroren ist.
Schließen Sie den Schwammbildungsprozess ab, indem Sie das gefrorene Hydrogel und das Wasserbad aus dem Gefrierschrank entfernen und bei 25 Grad Celsius auftauen. Entfernen Sie dann den resultierenden Schwamm aus dem aufgetauten Wasser. Um ein Lyogel vorzubereiten, eine gefrorene Hydrogelprobe auf einen Lyophilisator zu übertragen.
Nach 24 Stunden das endgültige lyophilisierte Gelmaterial aus dem Gefäß entfernen. Um Filme aus rekombinantem Spinnenseidenprotein herzustellen, werfen Sie 200 Mikroliter des heißen löslichen rekombinanten Spinnenseidenproteins aus der Durchstechflasche auf eine PDMS-Form der gewünschten Form. Nach dem Trocknen das PDMS-Substrat zur Prüfung oder Behandlung abziehen.
Um eine Beschichtung vorzubereiten, die nicht aus dem Substrat entfernt werden kann, verwenden Sie einen Airbrush-Sprüher, um das lösliche rekombinante Spinnenseidenprotein aufzutragen, um eine erste Sprühbeschichtung auf dem Substrat ihrer Wahl durchzuführen. Nach dem Trocknen das beschichtete Substrat in das lösliche rekombinante Spinnenseidenprotein untertauchen, um eine Dip-Beschichtung zu bilden. Wiederholen Sie die Tauchbeschichtung, um die gewünschte Dicke zu erreichen.
Um Klebstoffe zu bilden, verwenden Sie eine Pipette, um das lösliche rekombinante Spinnenseidenprotein auf ein Substrat zu geben, und tragen Sie dann ein zweites Substrat über der Oberseite der Lösung auf. Die Teile fest zusammenklemmen und die Proben dann mindestens 16 Stunden lang in einem Ofen mit einer Minimaltemperatur von 25 Grad Celsius trocknen. Um nass gesponnene Fasern zu erzeugen, verwenden Sie eine 19 Gauge Gleitnadel und laden Sie die lösliche Dope-Lösung in eine konzentrische Spritze mit einer Luer-Verriegelungsspitze.
Luftblasen auswerfen und die Dope am Luer-Schlossende der Spritze sitzen lassen. Legen Sie mindestens 25 Millimeter PEEK-Schläuche in die einteiligen fingerdichten Armaturen des PEEK-Schlauchs für einen über 16 Zoll Außendurchmesser und 10 über 32 Kamm ein. Ersetzen Sie die 19-Spur-Nadel mit diesem Setup auf dem Luer-Schloss-Buchsenadapter der Spritze.
Legen Sie dann Nitrilhandschuhe auf die Außenseite der Zwischengötter, um die zu entführende Faser vor dem Rutschen zu bewahren und um eine Beschädigung der Motoren zu vermeiden. Holen Sie sich ein hohes Klarglasbad mit 99% reinem Isopropanol, um es als Gerinnungsbad zu verwenden. Füllen Sie das erste Stretchbad mit einem Verhältnis von Isopropanol und destilliertem Wasser von 80 bis 20.
Im zweiten Stretchbad ein Verhältnis von Isopropanol und destilliertem Wasser von 20 bis 80 füllen. Richten Sie das Godet-Stretch-System auf dem Computer ein. Um die Hauptgeschwindigkeit der Faserentfernung einzustellen, passen Sie die Schiebestange für Godet Triplet A-Geschwindigkeit auf einen Wert zwischen 10 und 14 Millimeter pro Sekunde an, je nachdem, wie gut und schnell sich die Faser bildet.
Initiieren Sie eine erste Strecke, indem Sie die Schiebestange des Godet Triple B Stretch-Verhältnisses auf zwei für die letzte Godet im Stretchbad eins, Die mittlere obere Godet und die erste Godet im Stretchbad zwei bewegen. Initiieren Sie den zweiten Abschnitt, indem Sie die Schiebestange des Godet Triple C Dehnungsverhältnisses auf zwei für das letzte Godet im Stretchbad zwei, die letzte obere Godet und den Wicker bewegen. Dieses Setup sorgt dafür, dass die erste Godet nach dem Gerinnungsbad und die erste Godet im ersten Stretchbad mit der gleichen Geschwindigkeit rotieren.
Als nächstes laden Sie die Seidenlösung in die Spritze eines benutzerdefinierten Spin-Line-Instruments. Legen Sie im automatisierten System die Extrusionsrate auf 10 Millimeter pro Sekunde fest, um die Seidenlösung in das mit Isopropanol gefüllte Glasgerinnungsbad zu extrudieren. Lassen Sie die Faserextrusion gleichmäßig werden, bevor Sie die Fasern mit einem dünnen Metallhaken aus dem Bad ziehen.
Stellen Sie sicher, dass das Entfernen der Faser aus dem Bad eine Schleife zwischen der PEEK-Schlauchspitze und dem Pfad der Faser beim Verlassen des Bads erzeugt. Führen Sie die gewonnene Faser durch die Reihe von Godets, so dass die Faser in den Stretchbädern untergetaucht ist, aber in der Luft zwischen den Stretchbädern trocknet, und bevor Sie auf eine Spule gehen. In diesem Protokoll können durch eine Löslichkeit von rekombinantem Spinnenseidenprotein eine Vielzahl von Materialformen erreicht werden.
Sieben Materialformen werden hier vorgestellt. Hydrogele, Lyogel, Schwamm, Klebstoffe, Beschichtungen, Folien und Fasern. Fasern erfordern die umfangreichste Verarbeitung, indem sie in ein Gerinnungsbad extrudieren und dann die Rohfaser in Post-Bin-Stretch-Badewannen seriell dehnen.
Angesichts der Tatsache, dass die Protein- und Wasserlösungen auf eine relativ hohe Temperatur und einen relativ hohen Druck erhitzt werden, haben wir die Erfahrung gemacht, dass die Lösungen an dem Punkt steril sind, an dem das Protein gelöst wird. Dadurch kann jede der hier vorgestellten materiellen Formen in die Zellkultur gebracht werden, solange sie angemessen behandelt werden, um die zelluläre Reaktion auf die Materialien zu untersuchen. Sicherlich hat diese Technik zur Entdeckung neuer Materialformen geführt, einschließlich Klebstoffen und Schwammmaterial.
Materialformen, die nicht unbedingt auf Faserbildung ausgerichtet sind, obwohl die Faserbildung einer der Bereiche ist, die sich auch durch die Entwicklung dieser Technik verbessert haben. Die Erzeugung von Wärme und Druck in einer versiegelten Durchstechflasche birgt eine inhärente Gefahr. Tragen Sie bei der Durchführung dieser Verfahren immer persönliche Schutzausrüstung.
