失明のキャリア開発賞、トライ制度幹細胞イニシアティブを防止するためのNIH K08EY015829、R21EY019561、R24EY015656、P41 EB002520、およびR01 EY020856 Researchから資金を調達している。 HCLE細胞株は、博士アイリーンGipsonの礼儀を提供した。著者らは、細胞培養、SEMイメージングにおけるティッシュエンジニアリングリソースセンター（TERC）と彼女の技術支援のための特別な手術のため病院でアンソニーLabissiereで彼女の技術支援とご指導をワイルコーネル医科大学で博士Aihong劉に感謝したいと思います材料開発と技術サポートのためのタフツ大学、シリコンウェーハ製造の支援のためのナノスケール科学技術施設のコーネルセンター（CNF）。

1。シリコーンゴム金型の作製<ol><li>鋳造の目的の地形面を生成したり、購入してください。このパブリケーションの場合は標準の100ミリメートルエッチングされたシリコンウェハ（ 図1）について説明する。 </li><li>ポリジメチルシロキサン（PDMS）（コンポーネント）と購入したキットで提供される1時09分の比率（9グラムポッティングと1グラムの触媒）の触媒（成分B）ソリューションをポッティングを量る。 </li><li>硬化プロセスを開始するために徹底的に解決策を混ぜる。 </li><li>鋳造皿内の場所のシリコンウェーハ表面。 </li><li>シリコンウェハ上にPDMS液の4.5グラムを秤量する。 </li><li>ウェーハ表面の直径100mmの領域を覆うようにPDMSソリューションを広げる。 </li><li>均等にPDMSソリューションを広めるためにウェハを傾けてください。 </li><li>直径100mmのペトリ皿の蓋でウェハをカバーしています。 </li><li>場所は、硬化が平らな面に行われていることを特定すること、一晩60℃のオーブンにセットアップを鋳造。 </li><li>場所70％エタノールにPDMS /シリコンウエハー硬化削除する前にお風呂。 </li><li>最初のエッジ（全周）を持ち上げるためにカミソリの刃を使用してウエハからPDMSの削除を開始。 </li><li>静かにシリコーンゴム鋳造を引き裂くないように注意して70％エタノール槽内に鉗子を使用してオフにPDMSを引き出します。 </li><li> 14ミリメートル穴パンチを使用して、個々のPDMSモールドパンチアウト。この直径は、24ウェルプレートのセットアップに収まるように設計されています。 </li></ol> 2。シルクソリューションの生産<ol><li>ガラスビーカー7内沸騰蒸留水（のdH 2 O）の2 Lを持参してください。 </li><li>分にカイコ蚕の繭の5グラムをカットします。 </li><li>過度の昆虫微粒子コーティング内側の繭の表面によって示されるように広範囲に汚染された繭を廃棄してください。 </li><li>炭酸ナトリウムの4.24グラムを測定します。 </li><li>水のふきこぼれを防止し、続行する前に完全な溶解を可能にするために沸騰のdH 2 Oボリュームに徐々に炭酸ナトリウムを追加します。 </li><li>沸騰DHに繭の部分を追加します。 <su40分間b&gt;]を2 O、及び沸騰過程で繭をかき混ぜるためにテフロン被覆攪拌棒を使用しています。 </li><li>沸騰した後、慎重に余分な水分を除去するために手でシルクエキスよりシンクとリングにのdH 2 Oを排出する。 </li><li>シルクは20分を3回抽出洗浄します。ラボのビーカーでのdH 2 Oの1 Lの各、ビーカー内のボリュームを循環させるために攪拌棒を使用しています。 </li><li> 12時間の乾燥を可能にするために、化学フード内側に手と場所絹繊維抽出物による絹のエキスを洗浄した後、リング。期間。 </li><li>次の日、通常は〜3.5 gである乾燥した絹繊維を、重量：___________-G </li><li>シルク20％w / v溶液は9.3 M臭化リチウム溶液を調製します。必要な重量とボリュームを計算するには、次の方程式を利用する： <ol class="lalpha"><li> （ステップ10からシルクエキスの重量）×（4）=合計9.3 M臭化リチウム溶液の___________-mLの</li><li> [（807.705）×（一部11.AからLiBrのボリューム）] / 1000 = LiBrの___________ gはのdH 2 Oに追加する</li></ol> &lt;/ LI&gt; <li>以下のdH 2 O量のガラスビーカーに測定した臭化リチウムの重量を追加します。 <ol class="lalpha"><li> （0.8）×（ステップ11.Aから計算されたボリューム）= ___________のdH 2 O mLの</li></ol></li><li>メスシリンダー、一部締めくくりで計算された最後のボリュームにソリューションをもたらす適切なサイズにこのソリューションを注ぐ</li><li>ビーカーに絹のエキスを置き、シルク繊維はラボのスパチュラを用いて臭化リチウム溶液を内に浸漬されていることを確認すること絹繊維上の臭化リチウム溶液を注ぐ。 </li><li> 60に溶解した絹を置き°で4時間Cオーブン： 開始時刻：___________ 終了時間：___________ </li><li>適切なサイズのシリンジを使用すると、シルク液12 mLを策定する。注射器の先端に18G針を配置して、透析カセット（3,500 MWのcoutoff、スライド-Lyzer、サーモサイエンティフィック）に溶液を注入します。カセットを充填した後、空にシリンジでカセットのうち、残りの空気を描画します。 </li><li>場所FIのdH 2 Oの1 L中にlled透析カセット</li><li> 1時間、4時間、8時間後、6変化の合計3倍、12時間後のdH 2 O量を変更します。 <ol class="lalpha"><li>開始：___________ </li><li> 1時間：___________ </li><li> 4時間：___________ </li><li> 8時間：___________ </li><li> 12時間：___________ </li><li> 12時間：___________ </li><li> 12時間：___________ </li><li>終了：___________ </li></ol></li><li>透析後、ゆっくりとシリンジを用いてカセットから絹のソリューションを収集します。万グラム定格遠心チューブに配置するソリューションを提供します。 </li><li> 20分ごとに4℃で10,000 gで倍溶液を遠心分離します。新しいチューブに上清をそれぞれ遠心分離後の場所。 </li><li> 4℃の冷蔵庫で保管してTHRシルク·ソリューションを提供します。 </li><li>ピペット2つの小さな計量皿に0.5mLのシルクソリューションのサンプル、および場所は、12時間または絹溶液の乾燥するまで60°C乾燥炉内部に皿の重量を量る。 </li><li>ボットから残りの固体絹フィルムの重量を量るhは試料体積のタンパク質濃度に絹溶液の重量パーセントを測定する。 <ol class="lalpha"><li>合計2の絹フィルムサンプルの重量：___________ミリグラム</li><li> （23.aから重量）×（100）= ___________％シルク</li></ol></li></ol> 3。シルクフィルムと文化システムのセットアップの準備<ol><li>ほこりを削除するには、clearテープでクリーニングしてPDMS鋳造表面を準備します。 </li><li>きれいなPDMS基板70％エタノールに浸漬とのdH 2 Oで3回洗浄</li><li>一般的に24ウェルプレートのふたで押さえ板、上に場所14ミリメートルPDMSモールドを。 </li><li> 50μmの厚膜を生成するために、一般的に1 mLのシリンジ先端2は液体拡散ツールを使用して、PDMSモールドに8％の絹溶液を70μlsを広げた。 </li><li>シルクフィルムは90分の期間、150 Paの空気の流れの圧力を実行しているクリーンベンチやフィルム乾燥しているまで明らかに乾燥させます。 </li><li>かつて映画はPDMS mを含むフィルムの乾燥した場所全体のセットです。歳は、水不溶性のフィルムを製造するために&gt; 4時間水熱処理チャンバ内へ。これは通常、25 kPaの真空15で引っ張ら盆地の底に水と空のデシケーター室です。 </li><li>クリーンベンチの上に水熱処理チャンバーと場所から絹フィルムを取り外します。 </li><li>滅菌するために、少なくとも10分間、ウェル内に35ミリメートルのペトリ皿の中で70パーセントエタノール浴を準備し、代わりに制御基板（すなわち、ガラスまたはプラスチックの表面）とステンレス鋼リング。 </li><li>鉗子を用いてPDMSを鋳型から絹フィルムを取り出し、70％エタノールにそれらを浸し、確かにパターニング側を70％エタノール1 mLであらかじめ入力さ24ウェルプレートに配置するサンプルは、細胞接着を可能にするために上を向いている。 </li><li>上に対応するだけでなく場所のステンレス製リングの重み（11.65ミリメートル、内径、15.45ミリメートル、外径、1.18ミリメートルの厚さ）に、それぞれの絹フィルムのサンプルを配置した後。 </li><li>リングが付いているサンプルは無菌性を確保するために10分間インキュベートすることができます。 </li><li>レモEtOHをveとPBS 1 mLで3倍の各サンプルを洗浄します。各洗浄が完了した拡散を可能にするために5分間放置します。 </li><li>シルクフィルムサンプルの下に気泡の大部分を削除することを確認しながら、吸引ガラスピペットを用いてPBSを削除します。 </li><li>播種のセルラインを準備します。例として、7分間0.25％トリプシン及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液とヒト角膜輪部上皮-（HCLE）細胞株をトリプシン処理。トリプシンは10％FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）通路メディアの1:1のボリュームを使用して無効にするを追加しました。トリプシン処理HCLE細胞を遠心し、細胞ペレットにケラチノサイト無血清培地（K-SFM）の8 mLを加え、穏やかにHCLEsを分散させるために撹拌し、細胞数を生成します。 </li><li>よく一般的に10,000細胞/ cm 2の密度を使用して、当たりHCLE懸濁液サンプル500μL。 </li><li> 37℃インキュベーター内の場所の文化℃、5％CO 2および所望の実験プロトコルを実行します。 </li></ol> 4。代表的な結果 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> 絹の映画制作と文化システムの準備の要約を示す図1のフローチャートは、10ステップのプロセス。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> 図2標準的なフォトリソグラフィーとドライエッチング技術を用いた90 ​​ミリメートルの直径のシリコンウエハ上に生成するパターン化されたラインの表面トポグラフィの（A）21染料配列。 （B）シルクフィルムは、PDMSモールドの表面に鋳造した後に元の平行線パターン化の機能を保持します。 （C）回路図デモ機能·サイズ·デザインは、細胞の配置を促進するために選ばれた。 （D）を保持並列並んでパターン化表面を示すシルクフィルムのクロスセクションを参照してください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> 図3（）パターンに付着HCLE細胞株の走査電子顕微鏡写真と（B）培養中の2日目でフラットシルクフィルム。 HCLE文化は文化の日8（C）パターンと（D）平らな表面上でコンフルエントになるまで増殖し続けています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> 図4（A、D、G）パターニング（B、E、H）フラットシルクフィルム文化HCLE細胞は比較的に（C、F、I）ガラスの制御基板（AC）1日目、（DF）4日目で、文化と（GI）日8。 （J）CyQuant核酸含有量および（K）（3 - パターンとフラットシルクフィルム基板の両方にHCLE可能性を示す（4,5 - ジメチルチアゾール-2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT）の代謝活性の測定データ時間をかけてガラスのコントロールサーフェス（スケールバー= 100μm）に比較した場合。 ビデオ1で18時間の間にパターニングされた絹フィルム表面上に移行するHCLE細胞のタイムラプス位相コントラストイメージング。期間。細胞は10k/cm 2の密度で播種し、2時間培養した。イメージングの前に。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">ムービーを表示するには、ここをクリック</a> 。 ビデオ2で18時間の間に平らなTCP制御表面上に移行するHCLE細胞のタイムラプス位相コントラストイメージング。期間。細胞は10k/cm 2の密度で播種し、2時間培養した。イメージングの前に。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">ムービーを表示するには、ここをクリック</a> 。

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利害の衝突が宣言されません。

細胞培養の基質として再生され絹フィルムの使用は、このタンパク質の材料特性の広範な特性のために過去20年間にわたり人気を獲得し、その生体ユーティリティ3,8の理解を増加しています。ここで説明した培養系は、パターン絹フィルム生体材料基板7上で細胞表面の相互作用を評価するためのin vitro試験系で小説を表しています。システムは、容易に高スループットのデータ収集のために採用することができます時間をかけて細胞間相互作用の詳細な分析で可能になります。共有結合修飾または吸着を介して様々な表面化学、表面の制御マイクロ/ナノ表面形状7：絹フィルムを含むセルに直接関数を8,9,12に影響を与えるように変更することができます調整可能な生体材料のプロパティの数を持っているので、これは主として有効になっています堅牢なメカ、生物学的に活性な分子13のanicalプロパティ15,16、材料の親水性/疎水性16の制御、リリース4,8,17ための生物学的化合物のバルク·ロード、および二次構造の制御により制御された溶解/酵素分解率（βシートの内容）11,18,19 。 絹フィルムの透明度は水蒸気7,15の存在下で真空下で一定の時間アニールを行うことによって実現されます。この処理のアプローチは、光15の最小の回折を可能にしながら水に不溶性の材料を促進、β-シート二次構造の形成が可能になります。映画のこの透明性は、顕微鏡システム12,20は、任意の数を用いた撮像モダリティ（すなわち、広い視野と蛍光）の番号の下に用いることができる直接のライブセルイメージングを実現する上で鍵となります。ライブセルイメージングに加えて、シルクフィルムは容易に目から削除することができます追加の固定および分析を可能にするための電子培養系。したがって、このシステム上で実行することができます直接実験的評価の多種多様な多くの技術分野3,8,9,12,13,21のための細胞/組織、さまざまなソースに適用されます。タイムラプスイメージングの結果は、リアルタイムの培養データを収集する方法を説明し、例として、表面形状が細胞の相互作用をどのように影響するかを説明するために利用された。代表的な結果は、絹フィルムの生体材料がHCLE文化の成長をサポートするために利用することができる方法を示し、標準的な細胞増殖と代謝アッセイ（ 図4）の数に修正可能です。さらに、文化は固定されており、電子イメージングまたは他のプロトコルを（ 図3）スキャンのために処理されます。 シルクフィルム基板は、高忠実性、一貫性、と、比較的低コスト（ 図1）実験室で生産されています。これはreproduciを可能にする文化システムのセットアップと、実験結果の両方でbility。それは水アニール処理は、溶液2,15,22におけるプロテアーゼの濃度保留中の分解速度を定義している文化の中で安定した絹のフィルム材料を生成することが実証されている。その結果、これらの材料は、長期的な細胞培養のために長期間使用してもよいし、あるいは生理的な場所8日に応じて、数ヶ月または数年のために移植されたままになります。さらに、最近の研究は、タンパク質の構造と水アニール絹膜の材料特性の両方をバッチから様々な機械的および生物物理学的試験方法15,16を介して示されるように再現性の培養結果を可能にするバッチに一貫性があることが示されている。 7,23,24 SEM、原子間力micrscopy（AFM）、および細胞培養の研究{：2008wr、Omenetto：2008tc、ブレイ2011kqローレンス}で示されるように加えて、材料の表面は、フィルムバッチの中で偉大な忠実度を示している。材料STABILITYと一貫性は、細胞は様々なメカノ経路を介して培養基板を感知し、最終的には望ましい/望ましくない細胞応答25,26を生成する方法に重要な因子である。 そのような組織培養処理プラスチックやガラスなどの培養基質のための歴史的な基準は、細胞接着のために適切な基質を提供しています。しかしながら、これらの材料は、 生体内でさらにユーティリティの修正可能ではありません。それは絹フィルム生体材料は 、in vitro でカスタマイズすることができ、一度の実験期待がカスタマイズされたフィルムを直接in vivoモデルに変換することができますが達成されている。ことが想定できます。 in vitroおよび in vivo実験での間にそのようなペアのデザインは、日常的にin vitroで使用されている他の基板上にそのような植込み型シルクバイオマテリアルのための大きな利点を提供しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>絹の繭</td><td>田島商事株式会社。 </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMSモノマーと架橋剤</td><td>モメンティブ</td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S2127 </td></tr><tr><td>臭化リチウム</td><td>シグマ</td><td> 213225 </td></tr><tr><td>スライド-A-Lyzer </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 66110 </td></tr><tr><td> 1 mLのシリンジ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 309602 </td></tr><tr><td>ステンレス製のワッシャー</td><td>優れた洗濯機</td><td> 81610 </td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td> VWR </td><td> 353047 </td></tr></tbody></table>

silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design

シルクフィルムは、研究室の環境1,2内の高忠実度、経済的に作製することができる有望なタンパク質ベースのバイオマテリアルである。彼らは、高度に制御次元および材料特性を有する細胞接着を生体適合性の促進であるため、これらの材料が望ましいのですが、地形のパターン形成を介して、または化学的に表面を変えることによって変更することができ、薬物送達に関連するアプリケーションのための生物学的に活性な分子のデポとして使用することができます3-8さらに、絹フィルムは、数分以内に溶解またはin vitroまたは in vivo で長年にわたって低下するように設計することができ、カスタム設計するのは比較的簡単であり、自然の中で透明性のイメージングアプリケーション9したがって、非常に適しているという利点を生み出します- 13。ここで紹介する培養システムの方法論は、細胞絹膜表面の迅速な評価のためのスケーラブルなアプローチを表してい相互作用。特に興味深いのアライメント12,14のために細胞増殖と細胞の応答の違いを勉強するための表面パターニングされた絹フィルムの使用である。シード培養物は、マイクロパターンとフラットシルクフィルム基板の両方で培養し、タイムラプス位相コントラストイメージング、走査型電子顕微鏡、および代謝活性と核酸含量の生化学的評価を通じて評価した。要約すると、in vitroの培養系における絹フィルムは、in vivoモデルで最適化した後に翻訳することができる生体材料基板上に細胞表面の相互作用の研究に適したカスタマイズ可能な実験的なセットアップを提供しています。ここで紹介する培養系を用いた観測は、現在、基本的な細胞間相互作用から医療機器の設計に至るまでのアプリケーションを支援するために使用されているため、生物医学分野の広い範囲に関連しています。

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Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

シルクフィルムは、生物医学アプリケーションの配列のために容易にカスタマイズ可能な生体材料の新しいクラスです。提示絹フィルム培養システムは、様々な高度に適応可能です<em&gt; in vitroで</em&gt;分析。このシステムは、生体材料設計プラットフォームの提供を表し、<em&gt; in vitroで</emに直接変換する前に、&gt;最適化<emin vivoでの&gt;</em&gt;モデル。

用絹フィルム培養システム in vitroで分析とマテリアルデザイン

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

19.3K ビュー.  Weill Cornell Medical College. シルクフィルムは、生物医学アプリケーションの配列のために容易にカスタマイズ可能な生体材料の新しいクラスです。提示絹フィルム培養システムは、様々な高度に適応可能です in vitroで分析。このシステムは、生体材料設計プラットフォームの提供を表し、 in vitroで最適化モデル。

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

生物工学

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

の体系的な分析<em&gt;体外</emマルチウェルプレートマイクロ流体システムを使用して&gt;セルローリング

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

バイオメディカル応用のためのシルクシルクプロテイン合金材料設計

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

有毒吸入化学試験のためのin vitroでの細胞培養モデルにおける

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

モジュラー DNA デバイスの液体ハンドリング アセンブリを自動化

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

アン<em&gt;インビトロ</emマウス椎間板の&gt;器官培養モデル

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

ゼブラフィッシュ胚モデルにおける生体内可視化と生体材料の生体解析黄色ブドウ球菌感染症

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Design and Analysis for Fall Detection System Simplification

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system that can be easily implemented and adopted. The methodology is based on the configuration of specific types of sensors, machine-learning methods and procedures. The protocol is divided into four phases: (1) database creation (2) data analysis (3) system simplification and (4) evaluation. Using this methodology, we created a multimodal database for fall detection and human activity recognition, namely UP-Fall Detection. It comprises data samples from 17 subjects that perform 5 types of falls and 6 different simple activities, during 3 trials. All information was gathered using 5 wearable sensors (tri-axis accelerometer, gyroscope and light intensity), 1 electroencephalograph helmet, 6 infrared sensors as ambient sensors, and 2 cameras in lateral and front viewpoints. The proposed novel methodology adds some important stages to perform a deep analysis of the following design issues in order to simplify a fall detection system: a) select which sensors or combination of sensors are to be used in a simple fall detection system, b) determine the best placement of the sources of information, and c) select the most suitable machine learning classification method for fall and human activity detection and recognition. Even though some multimodal approaches reported in literature only focus on one or two of the above-mentioned issues, our methodology allows simultaneously solving these three design problems related to a human fall and activity detection and recognition system.

We present a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system. The goal is to build a system for accurate fall detection that can be easily implemented and adopted.

落下検知システムの単純化のための設計と解析

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition ...