このプロトコルは、細胞増殖に及ぼす影響について、2つのアッセイを同時に使用して数百の化合物をスクリーニングするための迅速かつ効率的な戦略を提供します。アッセイは、特定の化合物が細胞毒性であるか、細胞増殖を阻害するか、または細胞増殖を増強するかに関する情報を提供することができます。2つのアッセイを併用することで、精度を高め、細胞毒性化合物を同定することができます。
2つのアッセイの結果が発散する場合、この戦略は、他の手段でさらに調べることができる細胞機能に対するユニークな効果を有する化合物を同定することを可能にする可能性がある。この戦略の主な利点は、迅速で、安価で、非労働集約的であるということです。一度習得すると、研究者は簡単に1週間で最大200化合物の一次スクリーンを実行し、別の週に10〜15化合物に網羅的な用量応答曲線を実行することができます。
この手順を実証することは、私と研究室のスタッフ科学者でポストバカロレアフェローのロヒニ・マニカムです。まず、生物学的安全キャビネットにおいて、T75フラスコ内の培養細胞は、アッセイを開始する際に少なくとも80%コンフルエントとなるようにNSC培地を有する。そして、フラスコを摂氏37度と5%の二酸化炭素に設定した細胞培養インキュベーターに入れる。
細胞が80%合流したら、インキュベーターからフラスコを取り出し、NSC培地を吸引する。細胞解離試薬を3ミリリットル加え、インキュベーターで5分間インキュベートします。インキュベーション後、七ミリリットルのNSC培地をフラスコに加え、ピペットを精力的に加えて、すべての細胞が剥離されるようにします。
解約した細胞溶液を15ミリリットルチューブに移し、遠心分離機をGの200倍で5分間移動する。チューブから上清を取り除き、細胞を10ミリリットルのNSC培地で再懸濁します。細胞を数えるために自動細胞カウンターまたはヘモサイトメーターを使用し、1ミリリットル当たり200,000細胞に細胞の濃度を変更するためにチューブにNSC培地を追加します。
次いで、8チャンネルマルチチャネルピペットの8スロットのうち6個を使用して、細胞外マトリックスによってコーティングされた3つの96ウェルプレートの60の内部ウェルにカラムによって細胞混合物カラムの100マイクロリットルをプレートする。細胞を含む最も外側のウェルからの蒸発を最小限に抑えるために、細胞のないすべてのウェルに塩基媒またはNSC培地の100マイクロリットルを加える。細胞培養顕微鏡の下で、3つの96ウェルプレートのそれぞれに少なくとも10個の井戸を視覚的に検査し、細胞が予想される密度に着席していることを確認する。
摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートする。分割後16~24時間後に培養器から細胞培養プレートを取り出し、8つのマルチウェルピペットを用いてカラムでNSC培地カラムを吸引し、8つのマルチウェルスロットのうち6つだけを使用する。3つの複製プレートの各ウェルに95マイクロリットルの新鮮なNSC培地を加え、プレートをインキュベーターに戻します。
8チャンネルマルチウェルピペットを使用して、49マイクロリットルのNSC培地を空のU底、Vボトム、またはラウンドボトム96ウェルプレートの内部60ウェルに追加します。準備したマスターコンパウンドプレートをアンシールします。マスタープレートから各々の内部60ウェルにNSC培地を含む化合物の1マイクロリットルをピペットし、希釈した化合物をベンチトップピペットと3回混合する。
次に、インキュベーターからNSCの3つの96ウェルプレートを取り除き、希釈した化合物の5マイクロリットルを細胞を含む3つのプレートの各ウェルに分配し、DMSO濃度0.1%の化合物を含む10マイクロモルの最終化合物濃度に対して1〜1000希釈を生じ、シトー毒性アッセイを進めます。用量応答アッセイを行うために、96ウェルを設定する。6つのDMSO制御複製に2列目を使用し、10マイクロモルの高用量から始めて6回の用量で、2倍の連続希釈で最大3つの異なる化合物の三重化をテストする。
DMSOで4マイクロリットルのDMSOまたは試験化合物を0.5または1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管で196マイクロリットルのNSC培地に希釈します。希釈したDMSOの25マイクロリットルを加えて井戸をコントロールし、希釈した試験化合物を50マイクロリットルの希釈した試験化合物を対応するウェルに加えます。96ウェルプレートの内部部分に残りの空の井戸にNSC培地のピペット25マイクロリットル。
マルチチャネルピペットを使用して、化合物25マイクロリットルを10マイクロモルウェルから5マイクロモルウェルに移し、少なくとも5回混合する。ピペットの先端を交換し、残りの行を混合して、化合物のそれぞれについて合計6回の用量で2倍希釈液で三重化を生成することによってプロセスを繰り返します。各希釈液の5マイクロリットルを、試験中の培養細胞を持つ新しいプレートに移します。
プレートをインキュベーターに摂氏37度、二酸化炭素5%に置きます。細胞を72時間インキュベートした後、インキュベーターからプレートを取り出し、プレートリーダーの中に置きます。イメージャー ソフトウェアを開いて、スタディ用のプロトコルファイルと実験ファイルを設定します。
タスク マネージャで Imager 手動モードに移動し、[今すぐキャプチャ] をクリックします。容器のタイプとして96の井戸の版を選びなさい。倍率として10回、tdTomatoをイメージングする場合は赤色蛍光タンパク質531および593を選択します。
井戸をクリックしてください。次に、[オートフォーカス]をクリックして画像をフォーカスし、適切な露出時間を自動公開します。必要に応じて、手動でフォーカスと露出を調整します。
カメラアイコンをクリックして、画像をキャプチャします。次に、プロトコルの構築を続行するには、上の画像の [分析の処理] をクリックします。をクリックし、[解析]タブを選択します。
画像の右側にある [分析の追加] ステップで [セルラー分析] をクリックし、[開始] をクリックします。画像は、個々のセルを示すハイライトされたセルを示しています。[オプション]をクリックすると、蛍光閾値または細胞サイズに基づいてセルをより適切に選択するためのパラメータが変更されます。
イメージャーがセルを正しくカウントしている場合は、画面下部の[ステップの追加]をクリックします。画面の上部にあるアイコンをクリックして、イメージセットから実験を作成します。開いているウィンドウで、[プロトコル] タブの [プロシージャ] をクリックします。
次に、開いた新しいウィンドウで[読み取り]を選択します。[完全プレート] をクリックして、セルを含む 60 個のウェルのみを選択します。[OK] をクリックして変更を保存します。
次に、「手順」ウィンドウで「OK」をクリックします。再生アイコンをクリックして、プレートを実行します。プロンプトでファイルを保存し、プレートのロードのプロンプトで[OK]をクリックします。イメージングが完了したら、セルカウントデータをイメージャーソフトウェアプログラムから分析用のスプレッドシートにダウンロードします。
tdTomatoイメージングを完了してから2時間以内に、MTTアッセイを開始します。MTTの25ミリグラムを計量し、1ミリリットルMTTストック溶液あたり5ミリグラムを作るためにNSC培地の5ミリリットルでそれを再中断します。MTTの目に見える沈殿物がなくなるまで、溶液を数分間渦液。
培養器から細胞培養プレートを取り出し、細胞培養培地から吸引する。新鮮なNSC培地で1〜10までMTTを希釈し、希釈したMTTの100マイクロリットルを細胞の各ウェルに加えます。37°Cで細胞を2時間インキュベートします。
紫色の沈殿物は、ウェル内の細胞の数にほぼ比例して見える。プレートからMTT溶液を吸引し、各ウェルに100%DMSOの50マイクロリットルを加えます。プレートを400RPMで10分間室温のシェーカーに置きます。
その後、プレートをプレートリーダーに移します。595ナノメートルのプリセット波長で各ウェルの吸光度を読み取り、データを分析用にスプレッドシートにエクスポートし、細胞数データとまったく同じものを分析します。tdTomato蛍光画像の検査では、MTTと細胞数アッセイの間の毒性に対する2つのウェルが不一致である事が明らかになった。
1つの井戸について、細胞数データは毒性がないことを示唆した。しかし、MTTデータはそうでした。もう一つの井戸は、tdTomatoカウントに対してMTTによって細胞数を過大評価し、より大きな細胞を有するように見えたのに対し、MTTがtdTomatoに対して細胞数を過小評価している井戸では、細胞は小さく見えた。
要約すると、tdTomatoアッセイは11化合物を毒性、11化合物を増殖抑制剤、成長増強として1つを分類し、34は細胞増殖に明らかな影響を及ぼさない。MTTアッセイは、13の化合物を有毒、2つを増殖抑制剤、1つを増殖促進として分類し、41は細胞増殖に明らかな影響を及ぼさない。化合物WP1066の生存細胞のグラフは、4つの最低濃度の毒性のない比較的平坦な曲線を示す。
曲線は5マイクロモル線で急速に低下し、10マイクロモルでほぼ完全な毒性に低下し、tdTomatoアッセイとMTTアッセイの致死量50と4.4および6.0マイクロモルに至る。化合物が用量応答画面で適切に希釈され、正しい用量応答曲線が生成されるようにすることが重要です。細胞増殖に影響を与えるためにこの手順によって同定された化合物は、細胞増殖を制御する潜在的に新しいシグナル伝達経路を同定する機能的アッセイによってさらに特徴付けることができる。
神経幹細胞に対して毒性のある化合物は、神経膠芽腫や神経芽細胞腫などの脳癌の潜在的な治療薬としてテストされています。哺乳類の細胞、DMSO、MTTを扱う際には、常に手袋とラボコートを着用してください。お客様の機関の化学物質廃棄物ガイドラインに従ってDMSOとMTTを廃棄してください。
