Этот протокол предлагает быструю и эффективную стратегию одновременного использования двух анализов для проверки нескольких сотен соединений для их воздействия на рост клеток. Анализы могут предоставить нам информацию о том, являются ли конкретные соединения цитотоксическими, подавляют рост клеток или усиливают рост клеток. Используя эти два анализа вместе, мы можем повысить точность и определить цитотоксические соединения.
В тех случаях, когда результаты этих двух анализов расходятся, эта стратегия может позволить нам определить соединение с уникальным воздействием на клеточную функцию, которое может быть дополнительно изучено другими средствами. Основным преимуществом этой стратегии является то, что она быстрая, недорогая и неимутовная. После освоения, это позволяет исследователям легко выполнять первичный экран до 200 соединений в течение одной недели, а затем выполнить исчерпывающую кривую реакции дозы на 10 до 15 соединений в другую неделю.
Демонстрацией процедуры будет я и Рохини Маникам, штатный ученый и сотрудник лаборатории. Во-первых, в кабинете биологической безопасности, культурные клетки в колбе T75 со средой NSC, так что они будут по крайней мере 80% confluent при начале анализа. И поместите колбу в инкубатор клеточной культуры, установленный на уровне 37 градусов по Цельсию и пятипроцентный углекислый газ.
Как только клетки достигнут 80%слияния, удалите колбу из инкубатора и аспирировать от среды НСК. Добавьте три миллилитров реагента диссоциации клеток и инкубировать в течение пяти минут в инкубаторе. После инкубации добавьте семь миллилитров среды НСК в колбу и пипетку энергично, чтобы все клетки отсоединились.
Перенесите диссоциированный клеточный раствор в 15-миллилитровую трубку и центрифугу при 200 раз G в течение пяти минут. Удалить супернатант из трубки и повторно приостановить клетки в 10 миллилитров среды НСК. Используйте автоматизированный счетчик клеток или гемоцитометр для подсчета ячеек и добавьте среду NSC в трубку, чтобы скорректировать концентрацию клеток до 200 000 клеток на миллилитр.
Затем, используя шесть из восьми слотов восьмиканального многоканального трубоотвода, чтобы пластины 100 микролитров клеточной смеси колонки за колонной в 60 внутренних колодцев из трех 96 пластин скважины, которые были покрыты внеклеточной матрицы. Добавьте 100 микролитров базовой среды или среды НСК ко всем скважинам без ячеек, чтобы свести к минимуму потенциальное испарение из внешних скважин, содержащих клетки. Под микроскопом клеточной культуры, визуально проверить по крайней мере 10 скважин на каждом из трех 96 пластин скважины, чтобы подтвердить, что клетки сидят на ожидаемой плотности.
Инкубация при 37 градусах цельсия и пяти процентах углекислого газа. Удалите пластины культуры клеток из инкубатора через 16-24 часа после расщепления и аспирировать от средней колонки NSC по столбец с восьмиканалю multi-well pipettor, используя только шесть из восьми многофункциональных слотов. Добавьте 95 микролитров свежей среды NSC к каждому колодец из трех пластин репликации, и поместите пластины обратно в инкубатор.
С восьмиканалю многофункциональный трубоуправленец, добавить 49 микролитров НСК среды в каждом из внутренних 60 скважин пустой U-дном, V-дном, или круглым дном 96 хорошо пластины. Распечатать подготовленную мастером составную тарелку. Pipette один микролитер соединения из главной пластины в каждой из внутренних 60 скважин, содержащих НСК среды, и смешать разбавленное соединение три раза со скамейкой верхней трубоуправления.
Затем удалите три пластины 96 пластин NSCs из инкубатора и выпределите пять микролитров разбавленного соединения в каждую колодец из трех пластин, которые содержат клетки, чтобы дать от одного до 1000 разбавления для окончательной концентрации соединения 10 микромоляров с концентрацией DMSO 0,1%Incubate клеток с соединением в течение 72 часов, и приступить к цитототоксичности анализов. Для выполнения анализа реакции дозы, создать 96 хорошо. Используйте колонку 2 для шести репликаций управления DMSO и испытать трипликаты до трех различных соединений при двукратном серийном разбавлении, в шести дозах, начиная с высокой дозы 10 микромолей.
Разбавить четыре микролитера 100% DMSO или испытательного соединения в DMSO в 196 микролитров среды НСК в 0,5 или 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки. Добавьте 25 микролитров разбавленной ДМСО для управления скважинами и 50 микролитров разбавленных испытательных соединений к соответствующим скважинам. Pipette 25 микролитров НСК средних до оставшихся пустых скважин во внутренней части 96 пластины скважины.
С помощью многоканального трубоуправления перенесите 25 микролитров соединения из 10 микромолечных скважин в пять микромолечных скважин и смешайте не менее пяти раз. Заменить пипетки советы, и повторить процесс, смешивая оставшиеся ряды для создания тройной при двукратном разбавления в общей сложности шесть доз для каждого из соединений. Перенесите пять микролитров каждого разбавления в новую пластину с культурными клетками, которые проходят тестирование.
Поместите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия и пяти процентах углекислого газа. После инкубации клеток в течение 72 часов снимите пластину с инкубатора и поместите ее внутрь считыватель пластин. Откройте программное обеспечение для настройки протокола и экспериментальных файлов для исследования.
Перейдите в ручной режим Imager на менеджере задач и нажмите Capture Now. Выберите 96 хорошо пластины, как тип судна. Выберите 10 раз для увеличения, и красный флуоресцентный белок 531 и 593 для изображения tdTomato.
Нажмите на колодец. Затем нажмите на Autofocus, чтобы сфокусировать изображение, и Auto Expose для правильного времени экспозиции. Вручную отрегулируйте фокус и экспозицию, если это необходимо.
Нажмите значок камеры, чтобы захватить изображение. Затем нажмите Process Analyze выше изображения, чтобы продолжить создание протокола. И выберите вкладку Анализ.
Справа от изображения щелкните Сотовый анализ в шаге анализа добавления и нажмите Кнопку «Начать». На изображении показаны выделенные ячейки для обозначения каждой отдельной ячейки. Нажмите на выбор опций, чтобы изменить параметры, чтобы лучше выбрать ячейки на основе порога флуоресценции или размера клетки.
Если изображение правильно подсчитывает ячейки, нажмите Добавить шаг в нижней части экрана. Нажмите значок в верхней части экрана, чтобы создать эксперимент из набора изображений. А на открытое окно щелкните Процедуру под вкладкой Протокола.
Затем, в новом окне, которое открывается, выберите Read. Нажмите Полная плита, чтобы выбрать только 60 скважин, которые содержат клетки. Нажмите OK, чтобы сохранить изменения.
Затем нажмите OK в окне Процедуры. Нажмите значок воспроизведения, чтобы запустить пластину. В запросе сохраните файл, а затем в подсказке Load Plate щелкните OK. По завершении изображения загрузите данные о подсчете ячееок из программы Imager в электронную таблицу для анализа.
В течение двух часов после завершения tdTomato изображения, начать анализ MTT. Взвесить 25 миллиграммов МТТ и повторно приостановить его в пять миллилитров НСК среды, чтобы сделать пять миллиграммов на миллилитр MTT фондовый раствор. Вихрь раствор в течение нескольких минут, пока есть никаких видимых осадков MTT.
Удалите пластины клеточной культуры из инкубатора и аспирировать от среды клеточной культуры. Разбавить МТТ от одного до 10 в свежей среде НСК и добавить 100 микролитров разбавленного МТТ к каждой колодец клеток. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов.
Пурпурный осадок виден примерно пропорционально количеству клеток в колодеце. Аспирировать раствор МТТ с пластин, и добавить 50 микролитров 100% DMSO к каждой хорошо. Поместите тарелки на шейкер при комнатной температуре в течение 10 минут при 400 об/мин.
После этого перенесите пластину на считыватель пластин. Прочитайте абсорбцию каждой системы на заданной длине волны 595 нанометров и экспортируют данные в электронную таблицу для анализа, точно так же, как и данные о подсчете ячеек. Изучение изображений флуоресценции tdTomato выявило два скважины, несогласованные по токсичности между МТТ и анализом количество клеток.
С одной стороны, данные о подсчете клеток не свидетельствуют об токсичности. Но данные МТТ сделали. Другая скважина переоценила количество клеток МТТ по отношению к кол-во tdTomato и, как представляется, имела более крупные клетки, в то время как в скважинах, где МТТ недооценила количество клеток по отношению к tdTomato, клетки оказались меньше.
Таким образом, анализ tdTomato классифицировал 11 соединений как токсичные, 11 как ингибитор роста, и один как повышение роста, с 34, не имеющих явного влияния на рост клеток. Анализ MTT классифицировал 13 соединений как токсичные, два как ингибитор роста, и один как повышение роста, с 41 не оказывает очевидного влияния на рост клеток. График жизнеспособных клеток для соединения WP1066 показывает относительно плоскую кривую без токсичности для четырех самых низких концентраций.
Кривая быстро падает в пяти микромоляных дозах и падает почти до полной токсичности при 10 микромолях, что приводит к смертельной дозе 50 как 4,4 и 6,0 микромолара для анализа tdTomato и анализа MTT. Очень важно, чтобы соединения должным образом разбавляются в дозе ответ экран так, что правильная кривая реакции дозы генерируется. Соединения, выявленные этой процедурой для влияния на рост клеток, могут быть дополнительно охарактеризованы функциональными анализами для выявления потенциально новых сигнальных путей, которые контролируют рост клеток.
Соединения, которые являются токсичными для нервных стволовых клеток были протестированы в качестве потенциальных терапевтических агентов для рака мозга, таких как глиобластома и нейробластома. Всегда носите перчатки и лабораторное пальто при обработке клеток млекопитающих, DMSO и MTT. Утилизация DMSO и MTT в соответствии с Руководящими принципами химических отходов вашего учреждения.
