Este protocolo oferece uma estratégia rápida e eficiente para usar simultaneamente dois ensaios para triagem de várias centenas de compostos para seus efeitos no crescimento celular. Os ensaios podem nos fornecer informações sobre se compostos específicos são citotóxicos, inibem o crescimento celular ou melhoram o crescimento celular. Utilizando os dois ensaios juntos, somos capazes de aumentar a precisão e identificar compostos citotóxicos.
Nos casos em que os resultados dos dois ensaios divergem, essa estratégia pode permitir identificar compostos com efeitos únicos sobre a função celular que podem ser mais examinados por outros meios. A principal vantagem dessa estratégia é que ela é rápida, barata e não intensiva em mão-de-obra. Uma vez dominado, permite que os pesquisadores executem facilmente uma tela primária de até 200 compostos em uma semana e, em seguida, realizem uma curva de resposta de dose exaustiva em 10 a 15 compostos em outra semana.
Demonstrando o procedimento, seremos eu e Rohini Manickam, um cientista da equipe e pós-bacharelado do laboratório. Primeiro, em um gabinete de segurança biológica, células de cultura em um frasco T75 com meio NSC de modo que eles serão pelo menos 80% confluentes ao iniciar o ensaio. E coloque o frasco em uma incubadora de cultura celular fixada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Uma vez que as células atinjam 80% de confluência, remova o frasco da incubadora e aspire fora do meio NSC. Adicione três mililitros de reagente de dissociação celular e incubar por cinco minutos na incubadora. Após a incubação, adicione sete mililitros de meio NSC no frasco e pipeta vigorosamente para garantir que todas as células se despeçam.
Transfira a solução celular dissociada para um tubo de 15 mililitros e centrífuga a 200 vezes G por cinco minutos. Remova o supernatante do tubo e suspenda as células em 10 mililitros do meio NSC. Use um contador celular automatizado ou hemócitometro para contar as células, e adicione o meio NSC no tubo para reajustar a concentração de células para 200.000 células por mililitro.
Em seguida, utilizando seis das oito ranhuras de um pipettor multicanal de oito canais para a placa de 100 microliters da coluna de mistura celular por coluna em 60 poços interiores de três placas de poços de 96 que foram revestidas por matriz extracelular. Adicione 100 microliters de meio base ou meio NSC a todos os poços sem células para minimizar a evaporação potencial de poços mais externos que contêm células. Sob um microscópio de cultura celular, inspecione visualmente pelo menos 10 poços em cada uma das três placas de poços 96 para confirmar que as células estão sentadas na densidade esperada.
Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Remova as placas de cultura celular da incubadora 16 a 24 horas após a divisão, e aspire a coluna média NSC por coluna com um pipettor multi-poço de oito canais, usando apenas seis das oito ranhuras multi-poço. Adicione 95 microliters de meio NSC fresco a cada poço das três placas de réplica, e coloque as placas de volta na incubadora.
Com um pipettor multi-bem de oito canais, adicione 49 microliters de meio NSC em cada um dos 60 poços interiores de uma placa vazia com fundo em V, com fundo em V ou com fundo redondo de 96. Desslaque a placa composta mestre preparada. Pipeta um microliter do composto da placa principal em cada um dos 60 poços interiores contendo meio NSC, e misture o composto diluído três vezes com um pipettor superior de banco.
Em seguida, remova as três placas de poços de NSCs da incubadora e dispense cinco microlitadores do composto diluído em cada poço das três placas que contêm células para produzir uma diluição de um a 1000 para a concentração composta final de 10 micromolares com uma concentração de DMSO de 0,1% Incubar células com composto por 72 horas, e proceder com ensaios de citotoxicidade. Para realizar o ensaio de resposta à dose, configure um poço de 96. Use a Coluna Dois para seis réplicas de controle DMSO e teste triplicados de até três compostos diferentes em diluições seriais duplas, em seis doses, começando com uma alta dose de 10 micromolar.
Diluir quatro microlitres de 100% DMSO ou composto de teste em DMSO em 196 microliters de meio NSC em um tubo de microcentrifuge de 0,5 ou 1,5 mililitro. Adicione 25 microlitadores do DMSO diluído para controlar poços, e 50 microlitres dos compostos de teste diluídos aos seus poços correspondentes. Pipeta 25 microliters de médio NSC para os demais poços vazios na porção interna da placa de 96 poços.
Com um pipettor multicanal, transfira 25 microliters do composto dos 10 poços micromolar para os cinco poços micromolares, e misture pelo menos cinco vezes. Substitua as pontas da pipeta e repita o processo misturando as linhas restantes para gerar triplicados em diluições duplas para um total de seis doses para cada um dos compostos. Transfira cinco microliters de cada diluição para uma nova placa com células de cultura que estão sendo testadas.
Coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois que as células tiverem sido incubadas por 72 horas, remova a placa da incubadora e coloque-a dentro do leitor de placas. Abra o software de imager para configurar arquivos de protocolo e experimento para o estudo.
Vá para o modo manual do Imager no Gerenciador de tarefas e clique em Capturar Agora. Escolha 96 placas bem como o tipo de vaso. Selecione 10 vezes para a ampliação, e proteína fluorescente vermelha 531 e 593 para tdTomato de imagem.
Clique em um poço. Em seguida, clique em Foco automático para focar a imagem e Desacalar automaticamente para obter o tempo adequado de exposição. Ajuste manualmente o foco e a exposição, se necessário.
Clique no ícone da câmera para capturar a imagem. Em seguida, clique em Analisar imagem acima para continuar construindo o protocolo. E selecione a guia Análise.
À direita da imagem, clique em Análise Celular em Etapa de Análise adicionar e clique em Iniciar. A imagem mostra células destacadas para indicar cada célula individual. Clique na seleção Opções para alterar parâmetros para selecionar melhor as células com base no limiar de fluorescência ou no tamanho da célula.
Se o imager estiver contando corretamente as células, clique em Adicionar passo na parte inferior da tela. Clique no ícone na parte superior da tela para criar experimento a partir do conjunto de imagens. E na janela aberta, clique em Procedimento na guia Protocolo.
Em seguida, na nova janela que abre, selecione Ler. Clique em Placa Completa para selecionar apenas os 60 poços que contêm as células. Clique em OK para salvar alterações.
Em seguida, clique em OK na janela Procedimento. Clique no ícone Reproduzir para executar a placa. No prompt, salve o arquivo e, em seguida, no prompt 'Placa de carga', clique em OK. Após a conclusão da imagem, baixe os dados da contagem de células do programa de software imager para uma planilha para análise.
Dentro de duas horas após completar a imagem tdTomato, inicie o ensaio MTT. Pese 25 miligramas de MTT e suspenda-o em cinco mililitros de meio NSC para fazer cinco miligramas por solução de estoque MTT mililitro. Vórtice a solução por vários minutos, até que não haja precipitações visíveis de MTT.
Remova as placas de cultura celular da incubadora e aspire fora do meio de cultura celular. Diluir MTT de um a 10 em meio NSC fresco, e adicionar 100 microliters do MTT diluído a cada poço de células. Incubar células a 37 graus Celsius por duas horas.
Um precipitado arroxeado é visível aproximadamente em proporção ao número de células no poço. Aspire a solução MTT das placas e adicione 50 microliters de 100% DMSO a cada poço. Coloque as placas em um agitador à temperatura ambiente por 10 minutos a 400 RPM.
Depois disso, transfira a placa para um leitor de placas. Leia a absorção de cada poço no comprimento de onda predefinido de 595 nanômetros e exporte dados para planilha para análise, exatamente como para os dados de contagem de células. O exame das imagens de fluorescência tdTomato revelou dois poços discordantes para toxicidade entre o MTT e o ensaio de contagem de células.
Por um poço, os dados da contagem de células não sugeriram toxicidade. Mas os dados do MTT sim. Outro bem-estimado número de células por MTT em relação à contagem de tdTomato, e parecia ter células maiores, enquanto em poços onde o MTT subestimou a contagem de células em relação ao tdTomato, as células pareciam ser menores.
Em resumo, o ensaio tdTomato classificou 11 compostos como tóxicos, 11 como inibidores de crescimento e um como aumento do crescimento, com 34 não tendo efeito aparente no crescimento celular. O ensaio MTT classificou 13 compostos como tóxicos, dois como inibidores de crescimento e um como aumento do crescimento, com 41 não tendo efeito aparente no crescimento celular. O gráfico de células viáveis para o composto WP1066 mostra uma curva relativamente plana sem toxicidade para as quatro concentrações mais baixas.
A curva cai rapidamente na dose de cinco micromolares, e cai para uma toxicidade quase total em 10 micromolar, o que leva à dose letal 50 como 4,4 e 6,0 micromolar para o ensaio tdTomato e o ensaio MTT. É fundamental que os compostos sejam devidamente diluídos na tela de resposta da dose para que a curva de resposta da dose correta seja gerada. Compostos identificados por este procedimento para afetar o crescimento celular podem ser ainda mais caracterizados por ensaios funcionais para identificar vias de sinalização potencialmente novas que controlam o crescimento celular.
Compostos tóxicos para células-tronco neurais foram testados como potenciais agentes terapêuticos para cânceres cerebrais, como glioblastoma e neuroblastoma. Use sempre luvas e um jaleco ao manusear células de mamíferos, DMSO e MTT. Descarte DMSO e MTT de acordo com as Diretrizes de Resíduos Químicos de sua instituição.
