この再現性と容易なプロトコルを実行するには、元生体リンパ節イメージング戦略を使用して、生体内投与された蛍光標識抗体の局所的な二次リンパ器官への排出を追跡します。この手法をデモンストレーションすることで、プロトコルの実行を成功に導く手順を特定の視覚化できます。これは、誰でも実行できる非常にシンプルで簡単なテクニックです。
唯一の難しい側面は、いくつかのトレーニングを必要とするマウスの処理です。この技術は、従来の蛍光染色法に比べて組織の運動の維持および細胞生存率の向上という利点を有する。この手順の訓練は、研究室の技術者である立松ブレナです。
目的の抗体を希釈し、適切なフルオロフォアにコンジュゲートし、リンパ節イメージング用のPBSの100マイクロリットル、または、ポピタルリンパ節イメージング用のPBSの50マイクロリットルを用いた。リンパ節イメージングの場合、抗体カクテル100マイクロリットルを1ミリリットルのインスリン注射器にロードし、30ゲージを半インチ針で装備し、皮下に実験マウスの内側の大腿部に抗体を注入する。ポプライトリンパ節イメージングの場合、実験動物の1つの足パッドに皮下50マイクロリットルの抗体カクテルを注入する。
その後、その家箱に動物を返します。リンパ節の収穫を排出するイングイナルの場合は、注射から少なくとも3時間待った後、粘着テープでアクリルステージ上のマウスを固定化し、腹部の皮膚にミネラルオイルを塗布する。標準的なマイクロサージャリーハサミとマイクロサージャリー湾曲筋を使用して、陰部からキシフォイドプロセスまでの腹部の中耳切開を行い、腹部の筋肉を皮膚から解離する。
垂直切開線の上下に水平皮膚切開を行い、注射の側面に皮膚フラップを作成し、皮膚を引き込んでリンパ節を可視化する。皮膚フラップをアクリル板に固定し、鉗子を使用して半透明の、通常は眼球状の球状の水切りリンパ節を取り除きます。ポプリタルドレインリンパ節収穫については、注射後少なくとも12時間後に、マウスをアクリルステージ上の起こりやすい位置に固定化する。
動物の注入側の子牛と膝にミネラルオイルを塗ります。次に、かかとから膝までふくらはぎに中線切開を行い、皮膚からふくらはぎの筋肉を解離します。ポッテライトフォッサを公開します。
このポプライトリンパ節は、フォッサ内の半透明の球体として現れる。次に、マイクロサージャリー湾曲した鉗子でリンパ節を取り外す。イメージング用のリンパ節を準備するには、臓器全体をガラス底の35 x 10ミリメートルの培養皿に入れ、鉗子を使用して組織を取り巻く脂肪を取り除きます。
皿の真ん中に臓器を中央に置き、生理食い物に浸した繊細なタスクワイパーで組織を覆います。ex vivoイメージングの場合、皿を反転型共焦点顕微鏡スロットに配置し、共焦点顕微鏡の従来の光と4-10X目的を使用して正しい焦点を得る。光機能からレーザーモードに変更し、同位体染色、非染色、または非蛍光サンプルを使用して、レーザーパワー、オフセット、ゲインを調整して、蛍光と不特定の染色を除去します。
リンパ節構造と細胞分布に焦点を当てた4、10および20X目標の下で画像を取得し、1024 x 1024ピクセル定義を使用する。次に、適切なイメージング解析ソフトウェアプログラムを使用してチャネルを分離し、目的のスケールと色を追加し、3D ビューを再構築します。抗CD4および抗CD19抗体と共焦点イメージング分析とリンパ節細胞の免疫標識の強力な組み合わせにより、リンパ節内のT細胞およびB細胞の局在化が可能になる。
この亜大リンパ節では、イングイナル組織のように、B細胞卵胞は、T細胞集団に囲まれ、リンパ節構造の特徴である。これらの画像で観察されるように、食細胞は、注入された抗体を内在化せず、BおよびT細胞染色が特異的であることを示す。また、標識の再構成はT細胞染色とB細胞染色が重複しないことを示し、染色の特異性をさらに確認する。
単細胞細胞は、皮下の副頸部を含む、リンパ節全体で観察される。CX3XR1を発現する単核細胞の大部分では、CCR2およびCXCR31CCR2二重陽性細胞が続いた。同じ細胞分布と細胞の型のパターンが、その大極リンパ節で観察される。
両方のリンパ節はまた、リンパ球によって占有されている単核細胞受容体発現のない暗い領域を示す。さらに、単核球はリンパ節の内側領域内に乏しく、組織の外側領域に濃縮したままであり、これらの細胞が主にリンパ節下皮症を占めていることを示している。抗体混合物は、リンパ系の皮下組織に正確に注入して、抗体をリンパ節に適切に排出する必要があります。
この方法は、蛍光標識薬の生体分布、および蛍光標識ナノ粒子の細胞標的化研究に適用することができる。
