يستخدم هذا البروتوكول القابل للاستنساخ والسهل لتنفيذه استراتيجية تصوير العقدة الليمفاوية السابقة vivo لتتبع استنزاف الأجسام المضادة الفلورية التي تدار في vivo إلى الأعضاء اللمفاوية الثانوية المحلية. يسمح إثبات هذه التقنية بتصور محدد للإجراء ، مما يسهل التنفيذ الناجح للبروتوكول. هذا هو تقنية بسيطة جدا ومباشرة التي يمكن أن يؤديها أي شخص.
الجانب الوحيد الصعب هو التعامل مع الماوس ، الأمر الذي يتطلب بعض التدريب. هذه التقنية لديها فائدة من تحسين سرعة الحفاظ على الأنسجة و viability الخلية بالمقارنة مع أساليب التلطيخ الفلورسنت التقليدية. وسيكون تدريب الإجراء هو برونا تاتماتسو، وهو فني من المختبر.
تمييع الأجسام المضادة من الفائدة، مترافقة مع الفلوروفورس المناسبة، في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لتصوير العقدة الليمفاوية الإربية، أو 50 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لتصوير العقدة الليمفاوية الزنجي. لتصوير العقدة الليمفاوية الإربية، قم بتحميل 100 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة في حقنة إنسولين ذات ملليلتر واحدة، مجهزة بـ 30 مقياسًا بإبرة نصف بوصة، وحقن الأجسام المضادة تحت الجلد في الفخذ الداخلي للماوس التجريبي. لتصوير العقدة الليمفاوية الزجرية ، حقن 50 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة تحت الجلد في وسادة مخلب واحدة من الحيوان التجريبي.
ثم ارجع الحيوان إلى صندوقه المنزلي. لالأربي استنزاف حصاد العقدة الليمفاوية، بعد الانتظار ما لا يقل عن ثلاث ساعات من الحقن، وشل الماوس على مرحلة الاكريليك مع شريط لاصق وتطبيق الزيت المعدني على جلد البطن. استخدم مقص الجراحة المجهرية القياسية والملقط المنحني المجهري لإجراء شق جلدي في منتصف الخط في البطن من العانة إلى عملية الإكسيفود ، وفك عضلات البطن عن الجلد.
جعل شقوق الجلد الأفقي في الجزء العلوي والسفلي من خط شق عمودي، لخلق اللوحات الجلدية على جانب الحقن، والتراجع عن الجلد لتصور العقدة الليمفاوية. تأمين رفرف الجلد إلى لوحة الاكريليك، واستخدام ملقط لإزالة شفافة، وعادة ما تكون نصفية كروية الإربية استنزاف العقدة الليمفاوية. لpopliteal استنزاف حصاد العقدة الليمفاوية، على الأقل 12 ساعة بعد الحقن، وشل الماوس في موقف عرضة على مرحلة الاكريليك.
تطبيق الزيوت المعدنية على العجل والركبة على الجانب المحقون من الحيوان. بعد ذلك، قم بعمل شق في منتصف الساق من الكعب إلى الركبة، وفك عضلات العجل عن الجلد. فضح فوسا popliteal.
سوف تظهر العقدة الليمفاوية البوبيتية ك كرة شفافة داخل فوسا. ثم، إزالة العقدة الليمفاوية مع ملقط المنحنية microsurgery. لإعداد العقدة الليمفاوية للتصوير، ضع الأعضاء بأكملها في طبق ثقافة 35 في 10 ملليمترات مع قاع زجاجي، واستخدم ملقط لإزالة أي دهون تحيط بالأنسجة.
مركز الجهاز في منتصف الطبق، وتغطية الأنسجة مع قطعة من ماسحة مهمة حساسة غارقة في الملح. للتصوير فيفو السابق، ضع الطبق في فتحة المجهر المقلوب واستخدام الضوء التقليدي للمجهر confocal والهدف 4-10X للحصول على التركيز الصحيح. تغيير من وظيفة الضوء إلى وضع الليزر واستخدام النظائر الملطخة، غير الملطخة، أو غير الفلورسنت عينة لضبط قوة الليزر، وعوض، والحصول على لإزالة الفلورسنس التلقائي وأي تلطيخ غير محدد.
الحصول على الصور تحت أهداف 4 و 10 و 20X مع التركيز على هيكل العقدة الليمفاوية والتوزيع الخلوي واستخدام تعريف 1024 من قبل 1024 بكسل. ثم استخدم برنامج تحليل التصوير المناسب لفصل القنوات، لإضافة المقياس والألوان ذات الأهمية، وإعادة إنشاء العرض ثلاثي الأبعاد. مزيج قوي من المناعة من خلايا العقدة الليمفاوية مع الأجسام المضادة CD4 وC19 المضادة وتحليل التصوير confocal يسمح توطين الخلايا T و B داخل الغدد الليمفاوية الاربية.
في العقد اللمفاوية الزجرية ، كما هو الحال في الأنسجة الأربية ، تحيط بصيلات الخلية B بفئات الخلايا T ، وهي السمة المميزة لهيكل العقدة الليمفاوية. كما لوحظ في هذه الصور، لا تقوم البالعات ب تدخيل الأجسام المضادة المحقونة، مما يشير إلى أن تلطيخ الخلية B و T محدد. وعلاوة على ذلك، فإن إعادة بناء الوسم تشير إلى أن تلطيخ الخلية T وB لا يتداخل، مما يؤكد كذلك خصوصية التلطيخ.
ويلاحظ الخلايا أحادية الخلية في جميع أنحاء العقدة الليمفاوية الإربية, بما في ذلك الجيوب الأنفية. مع غالبية الخلايا أحادية النوى التعبير عن CX3XR1، تليها الخلايا الإيجابية المزدوجة CCR2 و CXCR31CCR2. ويلاحظ نفس النمط من توزيع الخلايا والأنماط الظاهرية الخلية في العقدة الليمفاوية الزفيرة.
كلا العقد الليمفاوية أيضا عرض المناطق المظلمة دون تعبير مستقبلات الخلايا أحادية النوى التي تحتلها الخلايا الليمفاوية. وعلاوة على ذلك ، فإن الخلايا أحادية النوى نادرة داخل المنطقة الداخلية من الغدد الليمفاوية ، وتبقى مركزة في المناطق الخارجية من الأنسجة ، مما يشير إلى أن هذه الخلايا تحتل في المقام الأول الجيوب الأنفية الفرعية العقدة الليمفاوية. يحتاج خليط الأجسام المضادة إلى حقنه بدقة في الأنسجة تحت الجلد للجهاز اللمفاوي لتصريف الأجسام المضادة بشكل صحيح إلى العقدة الليمفاوية.
ويمكن تطبيق هذه الطريقة على التوزيع البيولوجي للعقاقير الفلورية المسماة، وعلى دراسات استهداف الخلايا للجسيمات النانوية المسماة بالفلور.
