この作品は、NCI 1R01CA154656、NIAID 1R21AI092299、がん研究所、聖剣帯財団、ダナ財団、ガブリエルのエンジェル財団、アメリカの現代（ヒョンデ）自動車の &quot;ホープ·オン·ホイール&quot;プログラムからの助成金によってサポートされています。

1。マウス·ホルダ·アセンブリ<ol><li>下向きに100 mmのプラスチックシャーレの蓋の上に100 mmのガラスシャーレの蓋を重ねる。ガラスはほとんどプラスチック皿の中心点に触れなければならない。ステンシルとしてガラスを使用して、プラスチック製の皿の上にマークをトレースします。 </li><li>三日月型のプラットフォームを作成するには、100 mmのプラスチックシャーレの蓋の部分を削除するには、ハンドドリル（すなわち、ドレメル）を使用します。この三日月形のプラスチック製のふたは、マウスの上部の胴（図1a）のサポートとして機能します。金属製のツイストタイでガスマスクを確保するために三日月形の蓋にある2つの穴を開けます。スーパー接着剤または同等の強力な接着剤（図1b）を用いて、ガラスペトリ皿の縁にプラスチック製の蓋を固定します。 </li><li>接着剤2ドーム型キャップPCRチューブ（ヒンジで切断）離れて膝の皮膚フラップを固定する目的で底皿の中央に1cmのふた。 </li></ol> 2。マウスの準備<stroNG&gt;注意：十分な練習では、1つは20-30分で、マウスの準備や手術の手順を実行することができるはずです。 <ol><li> IACUC承認されたプロシージャを使用して、1L/minの流量で空気の混合物：1:1 O 2の混合イソフルランとマウス（誘導のための2から2.5パーセント、手術/イメージングのための1.5から2パーセント）を麻酔。マウスを麻酔したら、テープで鼻を介してガスマスクを固定します。マウスは、TOE及び/またはテールピンチへの応答の欠如によって完全に麻酔をかけているかどうかを判断します。イソフルランのレベルは、動物が完全に60から80回/分の間に安定した、非苦しい呼吸で鎮静されていることを確認するに応じて調整することができます。 </li><li>右後足とマウスの鼠径部の毛を削除するには、電動トリマーを使用しています。 </li><li>抜け毛をはらっゆっくりと綿棒で剃った領域にNairさんのローションのささやかなコートを適用します。最初のアプリケーションの1分後に、Nairさんを削除し、湿った露出した皮膚をきれいにペーパータオル。マウスが先に進む前に、清潔で乾燥していることを確認します。 </li><li>伸筋腱を公開するには、右膝にはさみで小さな2〜3mmの切開を行います。 </li><li>マウス本体と脚が配置され、マウスホルダーの中心に沿ってVetbond適用されます。慎重に右膝窩を公開するために、ダウンして右膝で、ホルダーの上にマウスを固定します。イメージング分野の安定化を助けるために2皮弁ホルダーの間にVetbondで右膝の腱を固定します。 </li><li>ホルダーの上位プラットフォームにストレッチやテープ腕と左脚。 </li><li>代わりに、ガスマスクを確保するためにツイストタイを使用しています。 </li><li>解剖顕微鏡下でホルダーを配置します。 LNは、絶対にまだマウスの呼吸運動の独立したままでなければなりません。足の安定性を最適化するために手術を行っている間そのため、注意が必要である。最大に貢献していきますテール（典型的に頭の上）の位置を決定する右脚とテープの下にテールの安定性。 </li></ol> 3。手術<ol><li>解剖スコープ下にある間、スペースヒータや加熱パッドを使用してマウスの体温を維持します。膝窩LNの成功イメージングするためには、常に露出した組織に温かいPBSを適用することにより、組織の水分を保持するだけでなく、手術中の適切な体温を維持することが重要です。 </li><li> Betadineで皮膚を消毒する。滅菌したハサミを使用して、右ふくらはぎに皮膚を通して正中切開を行い、右大腿部の優れた部分に垂直に切断し続けています。 </li><li>いずれかの側に皮膚フラップを作成するために垂直切開線の上部にある2つの水平方向の皮膚切開を行います。 </li><li> Vetbondの両方の皮膚フラップダウン撤回と接着剤。 Vetbondを適用する前にピンと張った皮膚を引っ張るとさらに足の安定性を促進しますが、（vesseすなわち変化皮膚の緊張が血流を閉塞しないことを確認してくださいlは、色や直径）。 LNを公開する前に、足の安定性を確保するために、皮膚の他の分野ダウン糊に進みます。マウスのサイズは、余分な皮膚が接着剤にダウンがどの程度必要であるかを決定します。一般的に、より大きなマウスは皮膚がホルダーに接着することが必要になります。 </li><li> LNは、ホルダーの上にマウスの位置に応じて、膝窩静脈の右側または左側のいずれかに膝窩内にある必要があります。ミクロ解剖ピンセットや鉗子を使用して、周囲の脂肪組織や筋肉からLNを慎重に分離します。出血や外傷を最小限に抑えるために、独立した組織へのマイクロ解剖ピンセットで溶射技術を使用しています。慎重に求心性と遠心性血管や求心性リンパ管の整合性を損なうことなく膝LNを公開します。 </li><li>追加された組織を安定させるために、正方形のカバーガラスは、血管閉塞を回避しながら、ぎりぎりLNに触れて、湿ったLN上に配置されることがあります。カバーガラスはSECURかもしれませんマウスのいずれかの側に粘土をモデリングするとED。 </li><li>様々なサイズ（例えばTRITC-デキストラン、70kDaの最小値）の蛍光血管色素は、撮影時のLNの構造的関係と整合性を強調するために、この時点で静脈内に導入することができる。 </li></ol> 4。 2光子イメージングの取得** <ol><li> LNが十分に露出されると安定性が達成されたら、速やかに37℃に保た環境顕微鏡チャンバー℃でプログラマブルな温度フィードバック制御ヒーティングパッドを装備顕微鏡ステージ上に全体のマウス·ホルダ·アセンブリを転送水没LNをするのに十分な滅菌暖かい（37℃）PBSまたはHBSSを追加します。ボリュームは、マウスのサイズと配置に応じて変更されます。また、温かいPBSまたはHBSSは、蠕動ポンプに取り付けられた微細なガラスピペットを介して解剖LNに直接適用され、浸レンズ対物レンズの列にテープで固定することができます。液体の流れがそのようにすべきである安定した水柱は、レンズと組織の間で維持することができます。 </li><li> 37℃でPBSまたはHBSS温度を維持°Cのフィードバックプローブを用いて加熱パッドを使用します。独立した温度プローブは、36.5から37.5℃の範囲でPBSの温度を確認するには、マウスホルダーに配置する必要があります直腸プローブはまた、イメージングセッションを通して、実験マウスの中核体温を監視するために使用されることがあります。 </li><li>目的の下にガイドLNの配置を支援するために落射蛍光灯を使用しています。希望する細胞間相互作用（通常は各xyzの画像スタックの間に10秒〜1分）に適した時間間隔を用いた蛍光画像スタックを取得します。 </li><li>目視検査したり、動物のモニタリングシステムを用いて頻繁に顕微鏡チャンバー内に動物の状態を監視します。マウスが完全につま先および/または爪のピンチへの応答の欠如により麻酔し、60〜80 Bの間の安定した、非苦しい呼吸であるかどうかを判断reaths /分。イソフルランのレベルは、動物が完全に鎮静されていることを確認するに応じて調整することができます。適切な監視と水和して、動物は4-6時間のために撮影されるか、あるいは長くすることができます。 </li><li>イメージング実験の後、IACUC承認された安楽死のプロトコルを使用して、CO 2チャンバーで動物を安楽死させる。動物は安楽死の前に麻酔から出てくることを許してはならない。 </li></ol> **この手術はまた、2P-LSM以外の生体内イメージングの他の形態のために役に立つかもしれません。 5。代表的な結果様々な循環免疫細胞移入後に異なるレートでLNに動員されています。 CD4 +およびCD8 +リンパ球、これらの細胞は2〜4時間6,17-18後、膝窩LNに到着した実質的な数字のIV転送後、高内皮細静脈（HEV）分を介してLNに到着し始める。 Bセルのためにlsは、かなりの数が8から24時間19後、蓄積されます。活性化樹状細胞は、足蹠注射3,11,16-17以下の排出膝窩LN 8から16時間以内に表示されるように開始する必要があります。図2aには、他のランドマークがない、そのようなB細胞濾胞として構造が2P-LSM 19歳未満に見える丸い球状の細胞の蓄積によって容易に識別できることを示しています。このようなユビキチン-GFPの脾細胞（図2、補足動画1と2）の内因性蛍光レポーターを使用して、1つは、非刺激性の生理学的条件の下で週に日、これらのリンパ球の移行や行動を追跡することができます。マルチチャンネルの高感度検出器と、それは構造情報だけでなく、17,19、複数の携帯パートナー間の相互作用のダイナミクスを含む多重イメージングのデータセットを取得することが可能です。 手術手技が適切に実行され、環境条件が注意深く監視され、lymphocy図2C、2Dおよび他13-14,16で示すようにTESは、特徴的な移動速度を示すべきである。リンパ球はまた、血管（のような容器染料の導入によって強調表示された）のようなので、追加のマークは、全体的な画像品質（すなわち、適切な温度制御を判断するのに役立ちますが、イメージングを受けたLNのサブ領域に応じて移動速度の違いを示すことができる、LN等への最小限の外傷）3,6,20。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> 図1。マウス膝窩LNイメージングのためのマウスホルダーの建設 ）は、マウス·ホルダ·アセンブリの概略図; b）の代表的な生体マウスの準備、c）に完成したマウス·ホルダ·アセンブリと、d）手術の暴露後窩LNの景色をクローズアップ。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> 図2。 GFP +リンパ球の移行解析膝窩LNに（a）はC57BL / 6レシピエントマウスに膝LNの2P-LSMの撮像シーケンスから取得した3Dスナップショットは、養子前の画像への1×10 7 GFP +リンパ球が1日に転送されます。破線は、B細胞濾胞の境界を示し、（b）の連続撮影1時間の間にリンパ球遊走の曲、全体のリンパ球遊走速度のc）の分布。 B細胞濾胞（オープンバーで見出される細胞のd）の差動細胞の移行速度分布;速度= 10.04±4.26μm/分を（解析15125トラックの合計）平均= 8.79±3.90μm/分の速度を意味し、合計1525トラックを分析）とT細胞ゾーン（黒棒、平均速度= 13.77±5.93μm/分、分析した1250トラックの合計）。スケールバー=50μmである。 補足ビデオ1、図2で説明したマウス膝窩のLNのタイムラプス生体2P-LSMのイメージング。 1×10 7リンパ球の合計が単離されたFROMユビキチン-GFP +ドナーマウスと養子、24時間イメージングする前に、C57BL / 6レシピエントマウスに静脈内転送されます。 xyのシリーズは（750μmのX 750μm）の蛍光画像は20秒ごとに繰り返されたXYZ画像のスタック（750μmのX 750ミクロン×65μm）を、得​​るために固定のZスタック（5μmのステップ、13ステップ）を介して撮影された60分の合計は、速度解析（図2C、2D）のxyzt撮像シーケンスの結果。再生速度= 450X。スケールバー=50μmである。タイムスタンプ=分：秒。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">補足ビデオを見るにはここをクリックしてください</a> 。 補足ビデオ2ズーム·イン、B細胞の毛包でのサプリメンタル·ビデオ1の撮像シーケンスの観点から- 。T細胞ゾーンの境界線。再生速度= 450X。スケールバー=25μmである。タイムスタンプ=分：秒<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>補足ビデオを見るにはここをなめる。

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	<li>Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+activation+by+dendritic+cells+in+the+lymph+node:+lessons+from+the+movies.">T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).</li><li>Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+friends+in+out-of-the-way+places:+how+cells+of+the+immune+system+get+together+and+how+they+conduct+their+business+as+revealed+by+intravital+imaging.">Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging.</a> Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).</li><li>Huang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+landscape+of+in+vivo+immunity:+insights+from+dynamic+in+situ+imaging+of+secondary+lymphoid+tissues.">Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-recognition+promotes+the+foreign+antigen+sensitivity+of+naive+T+lymphocytes.">Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes.</a> Nature. 420, 429-434 (2002).</li><li>Stefanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+self-recognition+in+T+cell+responses+to+foreign+antigen.">On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen.</a> Immunol. 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Med. 204 (3), 489-495 (2007).</li><li>Bajenoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=byways+and+breadcrumbs:+directing+lymphocyte+traffic+in+the+lymph+node.">byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node.</a> Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases.">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li><li>Mempel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues.">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).</li><li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy.">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).</li><li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. 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著者らは、開示には何もありません。

特に現場のイメージング技術、2P-LSM の高解像度での最近の進歩は、 生体内での動的な細胞挙動の研究への関心の高まりを伴っています。ライブマウスの膝窩LN上の4Dイメージング技術は、undisrupted組織微小環境内で免疫細胞の動的挙動のそのような分析を可能にします。可視スペクトル全体にまたがる複数の検出器と2P-LSMを使用すると、複数の細胞集団の同時イメージングデータ収集を可能にします。これは現在（有機蛍光細胞色素を用いた差動標識細胞集団の移入の使用と組み合わせてin vivoで細胞特異的な蛍光レポーターマウス（例えば、ユビキチン-EGFP-RFP、または-ECFP） での使用によって達成することができます例えば、CFSE 、SNARF-1、セルトラッカーオレンジ）LN内の細胞のメカニズムと機能を調べることができます。差動追跡cとの間の相互作用の直接観測に加えてエルの人口は、多重イメージングのデータセットには、さらに細胞の挙動と機能を解明するために市販の画像処理ソフトウェアのプログラム（例えばImaris、ビットプレーン社製）でさらに分析を受けることができます。可能性の広範な配列は、in vivoおよびin silicoでのテクニックでこれらを使用して細胞の相互作用のメカニズムを研究するために存在しています。 ここで説明する実験的なアプローチの主な制限は、手術のアプローチに内在する技術的な複雑さです。このテクニックは、関連する解剖と正確な技術的手続きと、このプロトコルで必要とされるスキルに精通するための厳しい訓練を必要とします。さらに複雑な要因は、撮像中に組織の安定性を最適化し、撮像実験の前と間にLNにサーマル、レーザー損傷を防止するため、LNの探査中に組織の損傷を最小限に抑えることの難しさがあります。これらの要因のいずれかへの摂動は、より少なくより最適なリンパ節になりますocyte運動したがって、イメージングデータの解析結果としての適切な解釈に干渉します。

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt;試薬</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;イソフルラン、USP</td&gt;<td&gt;バクスターヘルスケア株式会社</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nairさん - 脱毛ローション</td&gt;<td&gt; Nairさん</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS、1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;暖房パッド</td&gt;<td&gt;ワトロー</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;暖房パッドコントローラ</td&gt;<td&gt;ワトロー</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;航空O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgasの</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;温度プローブ</td&gt;<td&gt;ハーバード装置</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ピンセットデュモン第5位</td&gt;<td&gt;世界の精密機器株式会社</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td7センチメートル曲線&gt;鉗子、グレーフェアイリス、</td&gt;<td&gt;世界の精密機器株式会社</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;はさみ</td&gt;<td&gt; Roboz手術器具（株）、（株）</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 mmのガラスの細胞培養皿の&gt;カバー</td&gt;<td&gt;コーニング</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 mmのポリスチレン細胞培養皿の&gt;カバー</td&gt;<td&gt;コーニング</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Betadine溶液（10％Povidine-ヨウ素外用ソリューション）</td&gt;<td&gt;パデュー製品、LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

リンパ節（LNS）は、戦略的適応免疫応答を準備するために末梢組織からの外来抗原の捕捉とプレゼンテーションを可能にするために体全体に配置されており、二次リンパ器官である。自然免疫と適応免疫応答の間の並置、LNは、免疫細胞の相互作用1,2を研究する理想的なサイトです。リンパ球（T細胞、B細胞およびNK細胞）、樹状細胞（DC）、マクロファージは、LNの骨髄由来細胞成分の大部分を構成しています。これらの細胞は、戦略的に自己抗原および潜在的な外来抗原3-5の効率的な監視を可能にするためにLNに配置されている。リンパ球が正常に同族抗原に遭遇するプロセスは、近年の激しい調査の対象となり、抗原受容体、接着分子、ケモカイン、およびそのような線維網状ネットワーク2,6-12として間質構造体を含む分子の連絡先の統合を含む。 </p&gt; 前の唯一の形態、位置、およびアーキテクチャに関する答えを提供してin vivoイメージング、静的な画像に頼った捜査官、で高解像度のリアルタイム蛍光灯の開発に。これらの質問は、免疫細胞の挙動の理解に根本的なものですが、この手法の本質的な制限が解読リンパ球人身売買や動的な細胞の挙動に影響を与える環境手がかりに分析を許可されていません。最近、生体内の開発は二光子レーザー走査顕微鏡（2P-LSM）は、捜査官は現場 12月16日 のライブLNS内でダイナミックな動きと個々の細胞の相互作用を表示することができました。特に、我々と他のものは、そのコンパクトな、緻密な自然は、多様な組織のサブ構造11,17-18で大きな組織領域上の多重データ取得の利点を提供して膝LN、内のイメージ細胞挙動との相互作用にこの手法を適用している。それは私のこのテクニックは植血液の中断を必要とする組織のイメージング技術、リンパの流れ、およびシステムの最終的に細胞のダイナミクス上の追加の利点を提供していることに注意することが重要です。さらに、外植組織は、組織が外植後のイメージングのための生きたままでいる時間の非常に限られたウィンドウを持っています。動物の環境条件の適切な水分補給と監視により、撮像時間が大幅にこの生体内技術で拡張することができます。ここでは、生体内イメージングを行う目的で、マウス膝窩LNの準備の詳細な手法を提案する。

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Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

2光子顕微鏡の最近の進歩により、リアルタイムを有効にしている<em&gt;の</em&gt;その場の動物モデルでのライブの組織のイメージングことにより、生理学的および病理学の両方の条件で細胞の挙動を調べるために我々の能力を高める。ここでは、マウス膝窩リンパ節の生体内イメージングを実行するために必要な準備を概説しています。

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.2K ビュー.  Case Western Reserve University. 2光子顕微鏡の最近の進歩により、リアルタイムを有効にしているのその場の動物モデルでのライブの組織のイメージングことにより、生理学的および病理学の両方の条件で細胞の挙動を調べるために我々の能力を高める。ここでは、マウス膝窩リンパ節の生体内イメージングを実行するために必要な準備を概説しています。

ビデオ: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

鼠径リンパ節の生体顕微鏡

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

免疫・感染学

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

マウスの表在性リンパ節手術

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

マウスのリンパ脈管構造の非侵襲的光イメージング

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

ネズミリンパ節間質細胞の単離

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...