この作品は、NCI 1R01CA154656、NIAID 1R21AI092299、がん研究所、聖剣帯財団、ダナ財団、ガブリエルのエンジェル財団、アメリカの現代（ヒョンデ）自動車の &quot;ホープ·オン·ホイール&quot;プログラムからの助成金によってサポートされています。

1。マウス·ホルダ·アセンブリ<ol><li>下向きに100 mmのプラスチックシャーレの蓋の上に100 mmのガラスシャーレの蓋を重ねる。ガラスはほとんどプラスチック皿の中心点に触れなければならない。ステンシルとしてガラスを使用して、プラスチック製の皿の上にマークをトレースします。 </li><li>三日月型のプラットフォームを作成するには、100 mmのプラスチックシャーレの蓋の部分を削除するには、ハンドドリル（すなわち、ドレメル）を使用します。この三日月形のプラスチック製のふたは、マウスの上部の胴（図1a）のサポートとして機能します。金属製のツイストタイでガスマスクを確保するために三日月形の蓋にある2つの穴を開けます。スーパー接着剤または同等の強力な接着剤（図1b）を用いて、ガラスペトリ皿の縁にプラスチック製の蓋を固定します。 </li><li>接着剤2ドーム型キャップPCRチューブ（ヒンジで切断）離れて膝の皮膚フラップを固定する目的で底皿の中央に1cmのふた。 </li></ol> 2。マウスの準備<stroNG&gt;注意：十分な練習では、1つは20-30分で、マウスの準備や手術の手順を実行することができるはずです。 <ol><li> IACUC承認されたプロシージャを使用して、1L/minの流量で空気の混合物：1:1 O 2の混合イソフルランとマウス（誘導のための2から2.5パーセント、手術/イメージングのための1.5から2パーセント）を麻酔。マウスを麻酔したら、テープで鼻を介してガスマスクを固定します。マウスは、TOE及び/またはテールピンチへの応答の欠如によって完全に麻酔をかけているかどうかを判断します。イソフルランのレベルは、動物が完全に60から80回/分の間に安定した、非苦しい呼吸で鎮静されていることを確認するに応じて調整することができます。 </li><li>右後足とマウスの鼠径部の毛を削除するには、電動トリマーを使用しています。 </li><li>抜け毛をはらっゆっくりと綿棒で剃った領域にNairさんのローションのささやかなコートを適用します。最初のアプリケーションの1分後に、Nairさんを削除し、湿った露出した皮膚をきれいにペーパータオル。マウスが先に進む前に、清潔で乾燥していることを確認します。 </li><li>伸筋腱を公開するには、右膝にはさみで小さな2〜3mmの切開を行います。 </li><li>マウス本体と脚が配置され、マウスホルダーの中心に沿ってVetbond適用されます。慎重に右膝窩を公開するために、ダウンして右膝で、ホルダーの上にマウスを固定します。イメージング分野の安定化を助けるために2皮弁ホルダーの間にVetbondで右膝の腱を固定します。 </li><li>ホルダーの上位プラットフォームにストレッチやテープ腕と左脚。 </li><li>代わりに、ガスマスクを確保するためにツイストタイを使用しています。 </li><li>解剖顕微鏡下でホルダーを配置します。 LNは、絶対にまだマウスの呼吸運動の独立したままでなければなりません。足の安定性を最適化するために手術を行っている間そのため、注意が必要である。最大に貢献していきますテール（典型的に頭の上）の位置を決定する右脚とテープの下にテールの安定性。 </li></ol> 3。手術<ol><li>解剖スコープ下にある間、スペースヒータや加熱パッドを使用してマウスの体温を維持します。膝窩LNの成功イメージングするためには、常に露出した組織に温かいPBSを適用することにより、組織の水分を保持するだけでなく、手術中の適切な体温を維持することが重要です。 </li><li> Betadineで皮膚を消毒する。滅菌したハサミを使用して、右ふくらはぎに皮膚を通して正中切開を行い、右大腿部の優れた部分に垂直に切断し続けています。 </li><li>いずれかの側に皮膚フラップを作成するために垂直切開線の上部にある2つの水平方向の皮膚切開を行います。 </li><li> Vetbondの両方の皮膚フラップダウン撤回と接着剤。 Vetbondを適用する前にピンと張った皮膚を引っ張るとさらに足の安定性を促進しますが、（vesseすなわち変化皮膚の緊張が血流を閉塞しないことを確認してくださいlは、色や直径）。 LNを公開する前に、足の安定性を確保するために、皮膚の他の分野ダウン糊に進みます。マウスのサイズは、余分な皮膚が接着剤にダウンがどの程度必要であるかを決定します。一般的に、より大きなマウスは皮膚がホルダーに接着することが必要になります。 </li><li> LNは、ホルダーの上にマウスの位置に応じて、膝窩静脈の右側または左側のいずれかに膝窩内にある必要があります。ミクロ解剖ピンセットや鉗子を使用して、周囲の脂肪組織や筋肉からLNを慎重に分離します。出血や外傷を最小限に抑えるために、独立した組織へのマイクロ解剖ピンセットで溶射技術を使用しています。慎重に求心性と遠心性血管や求心性リンパ管の整合性を損なうことなく膝LNを公開します。 </li><li>追加された組織を安定させるために、正方形のカバーガラスは、血管閉塞を回避しながら、ぎりぎりLNに触れて、湿ったLN上に配置されることがあります。カバーガラスはSECURかもしれませんマウスのいずれかの側に粘土をモデリングするとED。 </li><li>様々なサイズ（例えばTRITC-デキストラン、70kDaの最小値）の蛍光血管色素は、撮影時のLNの構造的関係と整合性を強調するために、この時点で静脈内に導入することができる。 </li></ol> 4。 2光子イメージングの取得** <ol><li> LNが十分に露出されると安定性が達成されたら、速やかに37℃に保た環境顕微鏡チャンバー℃でプログラマブルな温度フィードバック制御ヒーティングパッドを装備顕微鏡ステージ上に全体のマウス·ホルダ·アセンブリを転送水没LNをするのに十分な滅菌暖かい（37℃）PBSまたはHBSSを追加します。ボリュームは、マウスのサイズと配置に応じて変更されます。また、温かいPBSまたはHBSSは、蠕動ポンプに取り付けられた微細なガラスピペットを介して解剖LNに直接適用され、浸レンズ対物レンズの列にテープで固定することができます。液体の流れがそのようにすべきである安定した水柱は、レンズと組織の間で維持することができます。 </li><li> 37℃でPBSまたはHBSS温度を維持°Cのフィードバックプローブを用いて加熱パッドを使用します。独立した温度プローブは、36.5から37.5℃の範囲でPBSの温度を確認するには、マウスホルダーに配置する必要があります直腸プローブはまた、イメージングセッションを通して、実験マウスの中核体温を監視するために使用されることがあります。 </li><li>目的の下にガイドLNの配置を支援するために落射蛍光灯を使用しています。希望する細胞間相互作用（通常は各xyzの画像スタックの間に10秒〜1分）に適した時間間隔を用いた蛍光画像スタックを取得します。 </li><li>目視検査したり、動物のモニタリングシステムを用いて頻繁に顕微鏡チャンバー内に動物の状態を監視します。マウスが完全につま先および/または爪のピンチへの応答の欠如により麻酔し、60〜80 Bの間の安定した、非苦しい呼吸であるかどうかを判断reaths /分。イソフルランのレベルは、動物が完全に鎮静されていることを確認するに応じて調整することができます。適切な監視と水和して、動物は4-6時間のために撮影されるか、あるいは長くすることができます。 </li><li>イメージング実験の後、IACUC承認された安楽死のプロトコルを使用して、CO 2チャンバーで動物を安楽死させる。動物は安楽死の前に麻酔から出てくることを許してはならない。 </li></ol> **この手術はまた、2P-LSM以外の生体内イメージングの他の形態のために役に立つかもしれません。 5。代表的な結果様々な循環免疫細胞移入後に異なるレートでLNに動員されています。 CD4 +およびCD8 +リンパ球、これらの細胞は2〜4時間6,17-18後、膝窩LNに到着した実質的な数字のIV転送後、高内皮細静脈（HEV）分を介してLNに到着し始める。 Bセルのためにlsは、かなりの数が8から24時間19後、蓄積されます。活性化樹状細胞は、足蹠注射3,11,16-17以下の排出膝窩LN 8から16時間以内に表示されるように開始する必要があります。図2aには、他のランドマークがない、そのようなB細胞濾胞として構造が2P-LSM 19歳未満に見える丸い球状の細胞の蓄積によって容易に識別できることを示しています。このようなユビキチン-GFPの脾細胞（図2、補足動画1と2）の内因性蛍光レポーターを使用して、1つは、非刺激性の生理学的条件の下で週に日、これらのリンパ球の移行や行動を追跡することができます。マルチチャンネルの高感度検出器と、それは構造情報だけでなく、17,19、複数の携帯パートナー間の相互作用のダイナミクスを含む多重イメージングのデータセットを取得することが可能です。 手術手技が適切に実行され、環境条件が注意深く監視され、lymphocy図2C、2Dおよび他13-14,16で示すようにTESは、特徴的な移動速度を示すべきである。リンパ球はまた、血管（のような容器染料の導入によって強調表示された）のようなので、追加のマークは、全体的な画像品質（すなわち、適切な温度制御を判断するのに役立ちますが、イメージングを受けたLNのサブ領域に応じて移動速度の違いを示すことができる、LN等への最小限の外傷）3,6,20。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3720/3720fig1.jpg" /> 図1。マウス膝窩LNイメージングのためのマウスホルダーの建設 ）は、マウス·ホルダ·アセンブリの概略図; b）の代表的な生体マウスの準備、c）に完成したマウス·ホルダ·アセンブリと、d）手術の暴露後窩LNの景色をクローズアップ。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3720/3720fig2.jpg" /> 図2。 GFP +リンパ球の移行解析膝窩LNに（a）はC57BL / 6レシピエントマウスに膝LNの2P-LSMの撮像シーケンスから取得した3Dスナップショットは、養子前の画像への1×10 7 GFP +リンパ球が1日に転送されます。破線は、B細胞濾胞の境界を示し、（b）の連続撮影1時間の間にリンパ球遊走の曲、全体のリンパ球遊走速度のc）の分布。 B細胞濾胞（オープンバーで見出される細胞のd）の差動細胞の移行速度分布;速度= 10.04±4.26μm/分を（解析15125トラックの合計）平均= 8.79±3.90μm/分の速度を意味し、合計1525トラックを分析）とT細胞ゾーン（黒棒、平均速度= 13.77±5.93μm/分、分析した1250トラックの合計）。スケールバー=50μmである。 補足ビデオ1、図2で説明したマウス膝窩のLNのタイムラプス生体2P-LSMのイメージング。 1×10 7リンパ球の合計が単離されたFROMユビキチン-GFP +ドナーマウスと養子、24時間イメージングする前に、C57BL / 6レシピエントマウスに静脈内転送されます。 xyのシリーズは（750μmのX 750μm）の蛍光画像は20秒ごとに繰り返されたXYZ画像のスタック（750μmのX 750ミクロン×65μm）を、得​​るために固定のZスタック（5μmのステップ、13ステップ）を介して撮影された60分の合計は、速度解析（図2C、2D）のxyzt撮像シーケンスの結果。再生速度= 450X。スケールバー=50μmである。タイムスタンプ=分：秒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video1.avi" target="_blank">補足ビデオを見るにはここをクリックしてください</a> 。 補足ビデオ2ズーム·イン、B細胞の毛包でのサプリメンタル·ビデオ1の撮像シーケンスの観点から- 。T細胞ゾーンの境界線。再生速度= 450X。スケールバー=25μmである。タイムスタンプ=分：秒<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3720/Huang_Jove_video2.avi" target="_blank">C</a>補足ビデオを見るにはここをなめる。

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</ol>

著者らは、開示には何もありません。

特に現場のイメージング技術、2P-LSM の高解像度での最近の進歩は、 生体内での動的な細胞挙動の研究への関心の高まりを伴っています。ライブマウスの膝窩LN上の4Dイメージング技術は、undisrupted組織微小環境内で免疫細胞の動的挙動のそのような分析を可能にします。可視スペクトル全体にまたがる複数の検出器と2P-LSMを使用すると、複数の細胞集団の同時イメージングデータ収集を可能にします。これは現在（有機蛍光細胞色素を用いた差動標識細胞集団の移入の使用と組み合わせてin vivoで細胞特異的な蛍光レポーターマウス（例えば、ユビキチン-EGFP-RFP、または-ECFP） での使用によって達成することができます例えば、CFSE 、SNARF-1、セルトラッカーオレンジ）LN内の細胞のメカニズムと機能を調べることができます。差動追跡cとの間の相互作用の直接観測に加えてエルの人口は、多重イメージングのデータセットには、さらに細胞の挙動と機能を解明するために市販の画像処理ソフトウェアのプログラム（例えばImaris、ビットプレーン社製）でさらに分析を受けることができます。可能性の広範な配列は、in vivoおよびin silicoでのテクニックでこれらを使用して細胞の相互作用のメカニズムを研究するために存在しています。 ここで説明する実験的なアプローチの主な制限は、手術のアプローチに内在する技術的な複雑さです。このテクニックは、関連する解剖と正確な技術的手続きと、このプロトコルで必要とされるスキルに精通するための厳しい訓練を必要とします。さらに複雑な要因は、撮像中に組織の安定性を最適化し、撮像実験の前と間にLNにサーマル、レーザー損傷を防止するため、LNの探査中に組織の損傷を最小限に抑えることの難しさがあります。これらの要因のいずれかへの摂動は、より少なくより最適なリンパ節になりますocyte運動したがって、イメージングデータの解析結果としての適切な解釈に干渉します。

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt;試薬</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;イソフルラン、USP</td&gt;<td&gt;バクスターヘルスケア株式会社</td&gt;<td&gt; NDC 10019-773-60</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vetbond</td&gt;<td&gt; 3M</td&gt;<td&gt; 1469SB</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nairさん - 脱毛ローション</td&gt;<td&gt; Nairさん</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS、1X</td&gt;<td&gt; Cellgro</td&gt;<td&gt; 21-040-CV</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;暖房パッド</td&gt;<td&gt;ワトロー</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;暖房パッドコントローラ</td&gt;<td&gt;ワトロー</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;航空O<sub&gt; 2</sub</td&gt;<td&gt; Airgasの</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;温度プローブ</td&gt;<td&gt;ハーバード装置</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ピンセットデュモン第5位</td&gt;<td&gt;世界の精密機器株式会社</td&gt;<td&gt; 14101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td7センチメートル曲線&gt;鉗子、グレーフェアイリス、</td&gt;<td&gt;世界の精密機器株式会社</td&gt;<td&gt; 14141</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;はさみ</td&gt;<td&gt; Roboz手術器具（株）、（株）</td&gt;<td&gt; RS-5880</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 mmのガラスの細胞培養皿の&gt;カバー</td&gt;<td&gt;コーニング</td&gt;<td&gt; 70165-102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td100x20 mmのポリスチレン細胞培養皿の&gt;カバー</td&gt;<td&gt;コーニング</td&gt;<td&gt; 430167</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Betadine溶液（10％Povidine-ヨウ素外用ソリューション）</td&gt;<td&gt;パデュー製品、LP</td&gt;<td&gt; NDC 67618-150-08</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

intravital imaging of the mouse popliteal lymph node

リンパ節（LNS）は、戦略的適応免疫応答を準備するために末梢組織からの外来抗原の捕捉とプレゼンテーションを可能にするために体全体に配置されており、二次リンパ器官である。自然免疫と適応免疫応答の間の並置、LNは、免疫細胞の相互作用1,2を研究する理想的なサイトです。リンパ球（T細胞、B細胞およびNK細胞）、樹状細胞（DC）、マクロファージは、LNの骨髄由来細胞成分の大部分を構成しています。これらの細胞は、戦略的に自己抗原および潜在的な外来抗原3-5の効率的な監視を可能にするためにLNに配置されている。リンパ球が正常に同族抗原に遭遇するプロセスは、近年の激しい調査の対象となり、抗原受容体、接着分子、ケモカイン、およびそのような線維網状ネットワーク2,6-12として間質構造体を含む分子の連絡先の統合を含む。 </p&gt; 前の唯一の形態、位置、およびアーキテクチャに関する答えを提供してin vivoイメージング、静的な画像に頼った捜査官、で高解像度のリアルタイム蛍光灯の開発に。これらの質問は、免疫細胞の挙動の理解に根本的なものですが、この手法の本質的な制限が解読リンパ球人身売買や動的な細胞の挙動に影響を与える環境手がかりに分析を許可されていません。最近、生体内の開発は二光子レーザー走査顕微鏡（2P-LSM）は、捜査官は現場 12月16日 のライブLNS内でダイナミックな動きと個々の細胞の相互作用を表示することができました。特に、我々と他のものは、そのコンパクトな、緻密な自然は、多様な組織のサブ構造11,17-18で大きな組織領域上の多重データ取得の利点を提供して膝LN、内のイメージ細胞挙動との相互作用にこの手法を適用している。それは私のこのテクニックは植血液の中断を必要とする組織のイメージング技術、リンパの流れ、およびシステムの最終的に細胞のダイナミクス上の追加の利点を提供していることに注意することが重要です。さらに、外植組織は、組織が外植後のイメージングのための生きたままでいる時間の非常に限られたウィンドウを持っています。動物の環境条件の適切な水分補給と監視により、撮像時間が大幅にこの生体内技術で拡張することができます。ここでは、生体内イメージングを行う目的で、マウス膝窩LNの準備の詳細な手法を提案する。

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Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

2光子顕微鏡の最近の進歩により、リアルタイムを有効にしている<em&gt;の</em&gt;その場の動物モデルでのライブの組織のイメージングことにより、生理学的および病理学の両方の条件で細胞の挙動を調べるために我々の能力を高める。ここでは、マウス膝窩リンパ節の生体内イメージングを実行するために必要な準備を概説しています。

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

intravital-imaging-of-the-mouse-popliteal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

28.3K ビュー.  Case Western Reserve University. 2光子顕微鏡の最近の進歩により、リアルタイムを有効にしているのその場の動物モデルでのライブの組織のイメージングことにより、生理学的および病理学の両方の条件で細胞の挙動を調べるために我々の能力を高める。ここでは、マウス膝窩リンパ節の生体内イメージングを実行するために必要な準備を概説しています。

ビデオ: Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

鼠径リンパ節の生体顕微鏡

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

免疫・感染学

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the initiation of an immune response 1. Here, we present methods for adoptive transfer of labeled T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node as first described in 2002 2. Two-photon imaging of immune cells requires that the cells are fluorescently labeled, either by staining with a cell tracker dye or by expressing a fluorescent protein. We demonstrate the adoptive transfer procedure of injecting cells derived from donor mice into the tail vein of a recipient animal, where they home to lymphoid organs within approximately 15-30 min. We illustrate the isolation of a lymph node and describe methods to ensure proper mounting of the excised lymph node. Other considerations such as proper oxygenation of perfused media, temperature, and laser power are discussed. Finally, we present 3D video images of naive CD4+ T cells exhibiting steady state motility at 37&deg;C.

Two-photon imaging has uncovered lymphocyte motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and durring an immune response 1. Here, we demonstrate adoptive transfer of T cells, isolation of lymph nodes, and imaging motility of CD4+ T cells in the explanted lymph node.

解剖とマウスの末梢リンパ節の2 - フォトンイメージング

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

生物学

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

マウスのリンパ脈管構造の非侵襲的光イメージング

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to draining lymph nodes (LNs). Interruption of lymph flow is an important method when studying the function of lymphatic vessels. The afferent lymphatic vessels from the murine footpad to the popliteal lymph nodes (pLNs) are well-defined as the only routes for lymph drainage into the pLNs. Suturing these afferent lymphatic vessels can selectively prevent lymph flow to the pLNs. This method allows for interference in lymph flow with minimal damage to the lymphatic endothelial cells in the draining pLN, the afferent lymphatic vessels, as well as other lymphatic vessels around the area. This method has been used to study how lymph impacts high endothelial venules (HEV) and chemokine expression in the LN, and how lymph flows through the adipose tissue surrounding the LN in the absence of functional lymphatic vessels. With the growing recognition of the importance of lymphatic function, this method will have broader applications to further unravel the function of lymphatic vessels in regulating the LN microenvironment and immune responses.

A protocol to block lymph flow by surgical suturing of afferent lymphatic vessels is presented.

マウスの不感性リンパ管を縫合することによりリンパ流を遮断する

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

医学

Popliteal Vascular Lymph Node Resection in the Rabbit Hindlimb for Secondary Lymphedema Induction

Lymphedema is a common condition often associated with cancer and its treatment, which leads to damage to the lymphatic system, and current treatments are mostly palliative rather than curative. Its high incidence among oncologic patients indicates the need to study both normal lymphatic function and pathologic dysfunction. To reproduce chronic lymphedema, it is necessary to choose a suitable experimental animal. Attempts to establish animal models are limited by the regenerative capacity of the lymphatic system. Among the potential candidates, the rabbit hindlimb is easy to handle and extrapolate to the human clinical scenario, making it advantageous. In addition, the size of this species allows for better selection of lymphatic vessels for vascularized lymph node resection.
In this study, we present a procedure of vascular lymph node resection in the rabbit hindlimb for inducing secondary lymphedema. Anesthetized animals were subjected to circumferential measurement, patent blue V infiltration, and indocyanine green lymphography (ICG-L) using real-time near-infrared fluorescence, a technique that allows the identification of single popliteal nodes and lymphatic channels. Access to the identified structures is achieved by excising the popliteal node and ligating the medial and lateral afferent lymphatics. Special care must be taken to ensure that any lymphatic vessel that joins the femoral lymphatic system within the thigh without entering the popliteal node can be identified and ligated. 
Postoperative evaluation was performed at 3, 6, and 12 months after induction using circumferential measurements of the hindlimb and ICG-L. As demonstrated during follow-up, the animals developed dermal backflow that was maintained until the 12th month, making this experimental animal useful for novel long-term evaluations in the management of lymphedema. In conclusion, the approach described here is feasible and reproducible. Additionally, during the time window presented, it can be representative of human lymphedema, thus providing a useful research tool.

<meta charset="utf8"></head><body>二次性リンパ浮腫誘発のためのウサギ後肢における膝窩血管リンパ節切除術

Here, the surgical induction of stable acquired lymphedema in the rabbit hindlimb is described. This experimental animal can be used to further investigate the effect of lymphedema treatment by microsurgical techniques.

二次性リンパ浮腫誘発のためのウサギ後肢における膝窩血管リンパ節切除術

Lymphedema is a common condition often associated with cancer and its treatment, which leads to damage to the lymphatic system, and current treatments are ...

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

要約

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二次性リンパ浮腫誘発のためのウサギ後肢における膝窩血管リンパ節切除術

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