肝細胞癌質量モデルを開発するためにモデルを使用するだけで、人々は腫瘍誘発性免疫寛容および特異的治療誘発、任意の腫瘍免疫応答を解明するのに役立つ可能性があります。肝線維化技術で発症する異所性腫瘍は、ヒト肝癌の臨床的特徴を模倣する。この方法は、肝細胞癌免疫学的研究に有用なツールを提供することができる。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、このプロトコルの実行を成功させるために不可欠な、より技術的に困難なステップ(脾臓内注入など)を示すことができます。次に、男性を手動で拘束し、6〜8週齢のC57黒6マウスの後側を上に立たします。代替70%エタノールとベタジンスクラブを使用して、注射部位を3回洗浄します。
その後、腹腔内注射により四塩化炭素160マイクロリットルをマウスに送り込み、動物を自宅のケージに戻します。足の指のピンチに対する応答の欠如を確認した後、5ヶ月齢のシミアンウイルス40 T抗原トランスジェニックマウスで、マウスを膝の位置に置き、テープで手足を固定する。リネアアルバの長さに沿って中線開腹を行い、肝臓の十分な暴露を提供するのに十分な大きさを作り、腸を左に置き換える。
肝臓の上を解剖して、下の大静脈を暴露する。血管をリゲートするために動脈クランプを誘導する。蝶の針を使用して、ポータル静脈への静脈内アクセスを取得し、手動でカテーテルを固定します。
各溶液の注射器を慎重に切り替え、15ミリリットルの溶液1、0.75%コラゲターゼ溶液2の15ミリリットル、カテーテルを介したコラゲターなしの溶液2を15ミリリットルの溶液を、毎分流量あたり約8.9ミリリットルの溶液で正常に供給します。灌流の終わりに、腫瘍質量をPBSの10〜15ミリリットルを含む50ミリリットル円錐管に収穫する。ちょうど実証したように、次のMTD2マウスから腫瘍を物品切除する。
はさみを使って肝臓を小さく切ります。組織片を完全なRPMI培地の5ミリリットルを含む50ミリリットルの円錐管に移す前に、組織の残りの部分を組織から除去するために、新鮮なPBSの新しい容器に組織を移します。5ミリリットルのピペットの先端を通して簡単に収まるまで、洗浄された肝臓サンプルをミンチします。
30ミリリットルの最終容積に達するためにチューブに十分な媒体を追加します。5ミリリットルのピペットを使用して組織断片をトリチュレートし、70マイクロメートルのストレーナーを通して溶液を新しい50ミリリットルチューブに濾過します。ストレーナーを完全な媒体で数回洗います。
追加の完全な媒体で50ミリリットルに最終的なボリュームを調整します。遠心分離を停止し、上清をデカントする前に、遠心分離によって懸濁液を最大50倍に素早く回転させます。次に、数えるPBSの20ミリリットルでペレットを再懸濁する。
MTD2肝細胞の脾臓内注射の場合、1匹のレシピエント動物ごとに27ゲージの注射器を1本ずつ、1匹のマウスにつき220マイクロリットルの肝細胞を搭載した注射器を積み込みます。麻酔を施した四塩化炭素処理動物におけるつまみつまみへの応答の欠如を確認する。脊椎筋のすぐ下から始まり、次に、左脇腹の1センチの切開を背側の極端から13番目の肋骨と平行にし、鈍い尖った鉗子を使用して脾臓を外装する。
脾臓の動脈と静脈の間に2つの中型チタンクリップで脾臓をクリップし、脾臓の下極に200マイクロリットルの細胞を送達します。ペディクルの下枝を1つの中型クリップでクリップし、最初に配置された2つのクリップの間で脾臓を切ります。腫瘍細胞を直接注射した脾臓の下極を取り除き、3-0ポリグラクチン910を使用して縫合を中断して内筋層を閉じる。
その後、滅菌されたスチール創傷クリップを使用して外皮層を閉じ、皮下にカープロフェンの1キログラム当たり5ミリグラムを投与する。示されるようにT抗原トランスジェニックマウスから単離した後、肝細胞および腫瘍浸潤細胞の両方が観察され得る。細胞は通常、処理後にほぼ100%生存率を示す。
野生型四塩化炭素処理動物への脾臓内接種後、移植された肝細胞は腫瘍特異的シミアンウイルス40T抗原を発現する正体性肝細胞癌腫瘍を正常かつ確実に増殖させる。MTD2質量からの肝細胞の私達の生存および純粋な集団の調製および脾臓内注射の正確な投与は、手順の成功にとって重要である。我々のチームは、血管内および腹腔内注射を介してレシピエントマウスへの肝細胞接種を試験したが、これらの他の方法は、正腸肝細胞癌を誘導することはできなかった。
このモデルは、免疫監視の調査と腫瘍進行の初期および後期段階での耐性を可能にするユニークなプラットフォームを提供します。四塩化炭素は有毒であるためご注意ください。
