Usar apenas um modelo para desenvolver um modelo de massa de câncer hepatocelular poderia ajudar as pessoas a elucidar sua imunotolerância induzida pelo tumor e tratamento específico induzido por tratamento, qualquer imunoresponse tumoral. O tumor ortotópico que se desenvolve com a técnica de fibrose hepática imita as características clínicas do câncer de fígado humano. Este método poderia fornecer uma ferramenta útil no estudo imunológico do câncer hepatocelular.
A demonstração visual deste método pode ilustrar os passos mais tecnicamente desafiadores, como a injeção intrasplenica, que são essenciais para uma execução bem sucedida deste protocolo. Em seguida, contenha manualmente um macho, de seis a oito semanas de idade C57 preto 6 mouse dorsal-side para cima. Use 70% de etanol alternativo e esfoliações betadinas para limpar o local da injeção três vezes.
Em seguida, entregue 160 microlitadores de tetraclorito de carbono ao camundongo por injeção intraperitoneal e devolva o animal para sua gaiola doméstica. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo do dedo, em um vírus símio de cinco meses de idade 40 T camundongo transgênico, coloque o rato na posição supina e fixe os membros com fita. Faça uma incisão de laparotomia média ao longo do comprimento da linha alba, grande o suficiente para fornecer uma exposição adequada do fígado, e deslocar os intestinos para a esquerda.
Dissecar acima do fígado para expor a veia cava inferior. Induzir um grampo de artéria para ligar o vaso. Use uma agulha borboleta para obter acesso intravenoso à veia portal e fixar manualmente o cateter.
Comutação cuidadosa de seringas para cada solução, entregue com sucesso 15 mililitros de solução um, 15 mililitros de 0,75% de solução de colagem 2 e 15 mililitros de solução dois sem colagem através de cateter, a uma velocidade de fluxo aproximada de 8,9 mililitros de solução por minuto. No final da perfusão, colide a massa tumoral em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 10 a 15 mililitros de PBS. Extir esse tumor do próximo rato MTD2 como apenas demonstrado.
Use uma tesoura para cortar os fígados em pedaços menores. Transfira os tecidos para um novo recipiente de PBS fresco para remover o resto do sangue do tecido antes de transferir os pedaços de tecido para um tubo cônico de 50 mililitros contendo cinco mililitros de meio RPMI completo. Pique as amostras de fígado lavadas até que os pedaços possam caber facilmente através da ponta de uma pipeta de cinco mililitros.
Adicione o meio suficiente ao tubo para atingir um volume final de 30 mililitros. Use uma pipeta de cinco mililitros para triturar os fragmentos de tecido, antes de filtrar a solução através de um filtro de 70 micrômetros em um novo tubo de 50 milímetros. Lave o coador várias vezes com meio completo.
Ajuste o volume final para 50 mililitros com meio completo adicional. Gire rapidamente a suspensão por centrifugação para um máximo de 50 vezes g antes de parar a centrífuga e decantar o supernatante. Em seguida, resuspende a pelota em 20 mililitros de PBS para contar.
Para injeção intrasplenica dos hepatócitos MTD2, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27 por cada animal receptor com 220 microlitídicos de hepatócitos por rato. Confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo em um animal anestesiado e tratado de tetraclorito de carbono. Começando logo abaixo do músculo da coluna vertebral, em seguida, faça uma incisão de um centímetro no flanco esquerdo paralela à décima terceira costela do extremo dorsal e use fórceps pontiagudas para exteriorizar o baço.
Corte o baço com dois clipes de titânio de tamanho médio entre a artéria esplênica e a veia, e entregue 200 microliters de células no polo inferior do baço. Corte o ramo inferior do pedículo com um clipe de tamanho médio e corte o baço entre os dois clipes inicialmente colocados. Remova o polo inferior do baço que foi injetado diretamente com células tumorais e use 3-0 poliglactina 910 interrompida para fechar a camada muscular interna.
Em seguida, use clipes de ferida de aço esterilizado para fechar a camada externa da pele e administrar subcutâneamente cinco miligramas por quilograma de carprofeno. Após o isolamento de camundongos transgênicos de antígeno T, como demonstrado, tanto hepatócitos quanto células infiltradas por tumores podem ser observados. As células normalmente demonstram uma viabilidade de quase 100% após o processamento.
Após a inoculação intrasplenica em animais tratados com tetraclorito de carbono selvagem, os hepatócitos transplantados crescem com sucesso e confiabilidade tumores de carcinoma hepatocelular ortotópico que expressam o vírus símio específico do tumor 40 T. A preparação de nossa população viável e pura de hepatócitos a partir da massa MTD2 e administração precisa da injeção intrasplenica são importantes para o sucesso do procedimento. Embora nossa equipe tenha testado a inoculação hepatocitada em camundongos receptores através de injeção intravascular e intraperitoneal, esses outros métodos não foram capazes de induzir carcinoma hepatocelular ortotópico.
Este modelo fornece uma plataforma única que permite a investigação para a vigilância imunológica e a tolerância em seus estágios iniciais e posteriores da progressão do tumor. Por favor, tenha cuidado ao usar o tetraclorito de carbono, pois é tóxico.
