간세포암 질량 모델을 개발하기 위해 단지 모델을 사용하면 사람들이 종양으로 유도된 면역 편성 및 특정 치료 유도, 종양 면역 반응을 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 간 섬유증 기술로 발전하는 치열토성 종양은 인간 간암의 임상 적 특징을 모방합니다. 이 방법은 간 세포암 면역학 연구에서 유용한 도구를 제공 할 수 있습니다.
이 방법의 시각적 데모는 이 프로토콜의 성공적인 실행에 필수적인 내장 주입과 같은 기술적으로 어려운 단계를 설명할 수 있습니다. 다음으로, 수동으로 남성, 6 ~ 8 주 된 C57 블랙 6 마우스 등쪽 업을 억제합니다. 대체 70%에탄올과 베타딘 스크럽을 사용하여 주사 부위를 세 번 청소하십시오.
그런 다음 관면 주사로 160 마이크로 리터의 탄소 테트라 클로리드를 마우스에 전달하고 동물을 홈 케이지로 돌려줍니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 5 개월 된 simian 바이러스 40 T 항원 형질 성 마우스에서, supine 위치에 마우스를 배치하고 테이프로 사지를 고정. 리나 알바의 길이를 따라 중간 라인 복강경 절개를 만들고, 간을 적절하게 노출시킬 수 있을 만큼 크고, 창자를 왼쪽으로 대체합니다.
열등한 베나 카바를 노출하기 위해 간 위로 해부하십시오. 동맥 클램프를 유도하여 선박을 리디게이트합니다. 나비 바늘을 사용하여 포털 정맥에 정맥에 대한 정맥 내 액세스를 얻고 카테터를 수동으로 고정하십시오.
각 솔루션에 대해 주사기를 신중하게 전환하여 15밀리리터 15밀리리터, 0.75%의 콜라게나아제 용액 2개, 카테터를 통한 콜라게나아제 없이 2밀리리터 15밀리리터를 분당 약 8.9밀리리터의 솔루션으로 성공적으로 제공합니다. 관류의 끝에서, PBS의 10 15 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원추형 관으로 종양 질량을 수확합니다. 방금 입증 된 대로 다음 MTD2 마우스에서 종양을 소비합니다.
가위를 사용하여 간을 작은 조각으로 자릅니다. 조직을 신선한 PBS의 새로운 용기로 옮기고 조직으로부터 나머지 혈액을 제거한 후 조직 조각을 5밀리리터 원칼 튜브로 이송하여 완전한 RPMI 배지의 5밀리리터를 함유한다. 조각이 5 밀리리터 파이펫의 끝을 통해 쉽게 들어갈 수 때까지 세척 된 간 샘플을 다진다.
튜브에 충분한 매체를 추가하여 30 밀리리터의 최종 볼륨에 도달합니다. 5밀리리터 파이펫을 사용하여 조직 조각을 세절화한 후 70마이크로미터 스트레이너를 통해 새로운 50밀리리터 튜브로 용액을 필터링합니다. 완벽한 매체로 여과기를 여러 번 씻으세요.
최종 볼륨을 50밀리리터로 조정하여 추가로 완전한 배지를 추가로 조정합니다. 원심분리기를 멈추고 상체를 탈착하기 전에 원심분리를 최대 50배까지 빠르게 회전시합니다. 그런 다음 계산을 위해 PBS의 20 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
MTD2 간세포의 내장 주입을 위해 마우스 당 220 마이크로 리터의 간세포와 각 받는 동물 당 27 게이지 바늘을 장착 한 밀리리터 주사기를로드합니다. 마취, 탄소 테트라 클로라이드 처리 동물에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 척추 근육 바로 아래에서 시작하여 왼쪽 측면에 1센티미터 절개를 하여 등기둥 익스트림에서 13번째 갈비뼈와 평행하게 만들고 무딘 뾰족한 포셉을 사용하여 비장을 외장화합니다.
비장 동맥과 정맥 사이에 두 개의 중간 크기의 티타늄 클립으로 비장을 잘라 비장의 열등한 극으로 200 마이크로 리터를 전달합니다. 페디클의 열등한 분기를 하나의 중간 크기의 클립으로 클립하고 처음에 배치된 두 클립 사이에 비장을 잘라냅니다. 종양 세포로 직접 주입된 비장의 열등한 극을 제거하고 3-0 폴리글락틴(910)을 사용하여 내근육층을 닫기 위해 봉합을 중단하였다.
그런 다음 멸균 된 강철 상처 클립을 사용하여 외부 피부 층을 닫고 1킬로그램당 5 밀리그램을 피하시 투여합니다. 입증된 바와 같이 T 항원 형질성 마우스로부터 의 절연 후, 간세포와 종양 침투 세포 모두 관찰될 수 있다. 세포는 전형적으로 처리 후에 거의 100% 생존성을 보여줍니다.
야생형 탄소 테트라클로리드 처리 동물로 내장 접종 후 이식된 간세포는 종양 특이적 시미안 바이러스 40 T 항원인정형세포암 종양을 성공적으로 안정적으로 성장시키고 안정적으로 성장한다. MTD2 질량에서 간세포의 실행 가능하고 순수한 인구의 준비와 내장 주사의 정확한 관리는 절차의 성공에 중요합니다. 우리 팀은 자궁 내 및 관면 주사를 통해 받는 쥐로 간세포 접종을 테스트했지만, 이러한 다른 방법은 정형 외 간 세포 암을 유도 할 수 없었다.
이 모델은 면역 감시및 종양 진행의 초기 및 후기 단계에서 내성을 위한 조사를 가능하게 하는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 탄소 테트라클로리드를 사용할 때는 독성이 있으므로 주의하십시오.
