腫瘍の再発は、分娩切除の非常に顕著な問題です。この研究では、再生環境における腫瘍の成長についてさらに理解しようとしています。腫瘍オルガノイドは、患者の腫瘍を組織学的および遺伝的に再現することが示されていますが、in vivoモデルは希少であり、安定性に欠けています。
私たちは、患者由来のオルガノイドをマウスの肝臓に移植することに成功しました。これを 2 つの例で示しました。組織学の免疫組織化学的染色は、オルガノイドと異種移植片が元の患者の腫瘍に似ていることを示しています。
元の腫瘍からのオルガノイドの作製は、2D細胞培養などの他の可能性と比較して、患者の腫瘍のより正確なモデルに似ています。このモデルを肝臓再生の複雑な環境に組み込むことで、腫瘍細胞と再生環境との間の既存の相互作用について理解を深めることができます。肝細胞がんの再発に関する肝細胞切除術の理解について、本研究室の知見を得ることができれば幸いです。
したがって、このモデルを使用して、将来の研究プロジェクトの基礎を作成したいと考えています。まず、メスと鉗子を使用して、採取した肝臓がん組織を1〜2平方ミリメートルの小さな断片に切断します。組織片を5ミリリットルの解離緩衝液を含む15ミリリットルのチューブに移します。
チューブを摂氏37度の回転装置に置きます。インキュベート後、50ミリリットルのチューブの上に置いた100μmのセルストレーナーに細胞混合物を通します。5ミリリットルのシリンジのプランジャーを使用して、フィルターを通して組織片を粉砕します。
次に、5ミリリットルのサプリメントの高度なDMEMをフィルターに加えて洗浄します。濾液を15ミリリットルの円錐管に移します。上清を吸引した後、ペレットを5ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。
懸濁液を再度300gで5分間遠心分離します。次に、カウントする前にペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。細胞プレーティングの前に、遠心分離機の細胞懸濁液から上清を取り除きます。
約1ミリリットルの基底膜マトリックスでチューブに再懸濁し、氷上に置きます。20マイクロリットルの細胞懸濁液を予温した6ウェルプレートのウェルにピペットで注入し、液滴を作成します。2〜3分待った後、プレートをフローキャビネットの逆さの位置に5分間置きます。
次に、プレートをインキュベーターに移して固化させます。最後に、2ミリリットルのオルガノイド培地を各ウェルに加えます。患者由来のオルガノイド系統は、元の患者腫瘍の形態学的特徴を示しました。
まず、麻酔をかけたマウスを仰臥位に置き、手足をテープで留めます。鉗子と顕微手術用ハサミを使用して、下腹部から剣状突起軟骨までの線形アルバに沿った枯渇した手術部位を切開します。リトラクターを切開部に挿入し、牽引の方向を調整して、上腹部の露出を最適化します。
生理食塩水で濡らしたきれいなナプキンを切開部位のすぐ隣に置きます。次に、小腸と盲腸を濡れたナプキンに外装します。注射が可能になるまで、右の上葉を露出させます。.
オルガノイド混合物をハミルトンシリンジとマークされたリンスに引き込みます。針を動かさずに、マークまでサスペンションをマウスに着実に注入します。注射部位に綿棒で圧力をかけます。.
次に、腹部に葉の破裂や逆流がないか確認します。腹部を0.5ミリリットルの滅菌生理食塩水ですすいでください。吸収性縫合糸を使用してランニング縫合糸を配置し、腹部を閉じます。
マウスで発生した腫瘍は、患者由来のオルガノイドと元の患者の腫瘍の両方に似ていました。軽度の肝臓切除を開始するには、仰臥位で麻酔をかけたマウスに開腹術を行います。湿った綿棒で内側葉を頭蓋骨に押して、手術野にスペースを広げます。
左外側肝葉を頭蓋側に反転させて、尾状葉と靭帯を露出させます。靭帯を完全に切断します。次に、外側肝葉の下に結紮糸を挿入します。
次に、左側肝葉を尾側に反転させ、結紮糸の左自由端を左外側肝葉の左端の周りに導きます。もう一方の先端の周りに右の自由端をガイドします。綿棒を使用してローブにトラクションを適用し、結紮糸が中央に配置されていることを確認します。
次に、ダブルハーフノットを結びます。この結び目を、完全に締めずに別の半分の結び目を反対方向に結んで固定します。結紮糸が適切に配置されたら、鈍い先端の鉗子で結紮糸の頭蓋自由端を保持し、別の鉗子で尾端を引っ張ります。
反対方向に結ばれた2番目の結び目で結び目を固定します。結紮糸を切らずに、結紮糸の近くで切断して肝臓を切除します。左外側肝葉の軽度切除後、鎌状靭帯を切除します。
葉を頭蓋骨にひっくり返し、その下に結紮糸を挿入して尾側にひっくり返します。次に、合字の自由ensを唇の周りにループします。結紮糸が正しく配置されたら、ゆっくりとダブルハーフノットを結びます。
2番目の半分の結び目を反対方向に完全に締めてから、3番目の半分の結び目を反対方向に追加します。葉を切除し、腹部を滅菌生理食塩水で洗い流します。腸を解剖学的な場所に戻します。
腹部を閉じるには、鉗子を使用して皮膚と腹膜をつかみます。切開線の上端に吸収性縫合糸でステッチを配置します。切開部の反対側で2回目のステッチを行い、皮膚側から出ます。
結び目をしっかりと結び、針が短くならないように自由端を残します。ステッチの針先を長くしておきます。切開部の下端に結び目を付けて、ランニング縫合糸を仕上げます。
残っている血液の腹部をきれいにします。肝葉の相対的な寄与は、同じ系統の異なるマウス間で同等です。右下葉の平均重量は、小切除後の全体重の0.82%に増加した。
大切除により、総体重の0.99%が増加した。右上葉の大切除は、右下葉に対するその重量の顕著な増加をもたらした。
