HPV RNA CISHは、ヒト乳頭腫ウイルス感染の能動性を検出することを可能にする。この技術は、HPV RNAを標的とするIn-in-situのハイブリダイゼーションにより、ウイルスの能動転写の可視化を可能にする。それは精密な空間分解能およびよい診断の性能を有する。
HPVの検出は、中咽頭扁平上皮癌または頸部腫瘍などのいくつかのHPV関連病変の診断を支持し得る。また、予後に影響を与える可能性があります。バッファーおよび対染色試薬を調製した後、630ミリリットルの蒸留水に70ミリリットルの10x標的回収試薬を加えて、大型ビーカーに1個のxターゲット検索試薬を調製します。
ビーカーをマグネットスターラー付きの加熱プレートに置き、アルミホイルで覆います。中身を100度に10~15分煮て、30分以上沸騰させないようにします。以前に脱パラフィンしてスライドラックに入れた組織切片を持つスライド上のペルオキシダーゼ活性をブロックするには、サンプルを覆うのに十分な4~6滴を加え、各スライドに過酸化水素を加え、室温で10分間インキュベートします。
スライドを室温で蒸留水で2分間2回洗います。RNA組織切片のRNA組織の境界を断ち切るために、まず爪を使って沸騰させた1つのx TRRからアルミ箔を取り出し、攪拌を停止する。スライドラックをゆっくりと慎重に浸します。
もう一度ビーカーをアルミホイルで覆い、15分間インキュベートします。爪を使ってすぐに熱いスライドラックを蒸留水浴に移し、2分間洗います。スライドを新鮮な100%エタノールで2分間洗い、室温で2分間乾燥させます。
次に、疎水性バリアペンを使用して各サンプルの周りにバリアを描き、少なくとも5分間乾燥させます。プロテアーゼの消化のために、湿度制御トレイにスライドを置き、サンプルごとにプロテアーゼプラスの約4滴を加えます。トレイに蓋をし、ハイブリダイゼーションオーブンに30分、摂氏40度で挿入します。
オーブンからトレイを取り出し、スライドラックを取り外します。一度に1スライドで作業し、すぐに余分な液体を取り除き、スライドラックにスライドを入れ、蒸留水で満たされた染色皿に浸します。スライドを室温で蒸留水で2回洗浄し、撹拌を一定にします。
ハイブリダイゼーションを開始するには、スライドをタップしてフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。オーブンから事前に温めたHPVプローブを取り出し、各セクションを完全に覆うために約4滴を加えます。トレイに蓋をし、40°Cで2時間オーブンに挿入します。
インキュベーションが完了したら、オーブンからトレイを取り出し、スライドラックを取り外します。一度に1つのスライドで、余分な液体を素早く取り除き、スライドラックに1つの洗浄バッファーを充填した染色皿に入れ、一定の攪拌で室温で2分間スライドを洗浄し、新鮮な1x洗浄バッファーで繰り返します。スライドから余分な液体を取り除くためにタップしてフリックし、再度スライドラックに入れ替えます。
各セクションを完全にカバーするために、セクションごとに約4滴の室温AMP1を追加します。トレイに蓋をし、オーブンに30分、摂氏40度で挿入します。オーブンからトレイを取り外した後、スライドラックを取り外します。
一度に1つのスライドで作業し、余分な液体を素早く取り除き、スライドラックに1つのx洗浄バッファーを充填した染色皿に沈め、室温で2分間洗浄し、新鮮な1 xの洗浄バッファーで繰り返します。各DAB-AおよびDAB-B溶液の同じ数の滴を適切なサイズのチューブに分配し、セクション当たり約120マイクロリットルのDAB基板と渦を作ります。スライドラックから各スライドを1つずつ取り出し、タップしてフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。
各組織セクションに約120マイクロリットルのDAB混合物をピペットし、セクションが覆われていることを確認する。室温で10分間インキュベートし、逆染色を進めます。1つのガラススラットに取り付け媒体を1滴置き、スライドの上にスラットを置き、空気乾燥させます。
数時間後、原稿に記載されている光学顕微鏡を用いた評価を進める。ここで述べたように頭頸部扁平上皮癌において、細胞質または腫瘍細胞の核における褐色の形態染色の存在は陽性の症例を定義した。結果は、20倍の目的で観察されたRNA CISHの高いスコアと低いスコアの2つのスコアに分けられた。
RNA CISHスコア染色は、腫瘍細胞の50%未満で観察された場合に低いと考えられ、細胞表面の80%未満をカバーする。一方、RNA CISHスコアは、染色された癌細胞の50%以上で観察された場合、または30%以上の腫瘍細胞において染色面が80%を超えると高い。ハイブリダイゼーションのためにスライドを乾燥させるべきではありません。
プローブを予熱することを忘れないでください。各サンプルについて、RNAの品質を評価するために正と負のコントロールを行います。
