РНК ВПЧ CISH позволяет выявлять активную инфекцию вируса папилломы человека. Поскольку гибридизация на месте нацелена на РНК ВПЧ, этот метод позволяет визуализировать активную транскрипцию вируса. Он имеет точное пространственное разрешение и хорошие показатели диагностики.
Обнаружение ВПЧ может поддерживать диагностику нескольких поражений, связанных с ВПЧ, таких как плоскоклеточный рак или неоплазия шейки матки. Это также может повлиять на прогноз. После подготовки буферов и контр-окрашивания реагентов, подготовить один х целевой реагент поиска в большой стакан, добавив 70 миллилитров 10x целевой реагент поиска 630 миллилитров дистиллированной воды.
Поместите стакан на нагревательную пластину с магнитным мешалки и накройте его алюминиевой фольгой. Отварить его содержимое при 100 градусах по Цельсию в течение 10-15 минут, убедившись, что не варить его дольше, чем 30 минут. Чтобы блокировать активность пероксидазы на слайдах с секциями тканей, ранее депарафинизированных и помещенных в стойку слайда, добавьте четыре-шесть капель, как раз достаточно, чтобы покрыть образец, перекиси водорода к каждому слайду, и инкубировать их в течение 10 минут при комнатной температуре.
Вымойте горки два раза в течение двух минут в дистиллированной воде при комнатной температуре. Чтобы разорвать РНК ткани границы в рнк ткани разделов, сначала удалить алюминиевую фольгу из кипящего один х TRR с помощью коготь, и прекратить перемешивание. Погрузите стойку слайда медленно и очень осторожно.
Накройте стакан снова алюминиевой фольгой и инкубировать в течение 15 минут. Используйте коготь, чтобы немедленно передать горячую стойку слайда на дистиллированную водяную ванну и мыть его в течение двух минут. Вымойте слайды затем в свежем 100%ethanol в течение двух минут, и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение двух минут.
Затем используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать барьер вокруг каждого образца, и дайте ему высохнуть, по крайней мере пять минут. Для пищеварения протеазы поместите слайды в лоток, контролируемый влажностью, и добавьте приблизительно четыре капли Protease Plus на образец. Накройте лоток крышкой и вставьте его в духовку гибридизации в течение 30 минут при температуре 40 градусов по Цельсию.
Выньте лоток из духовки и удалите стойку для слайдов. Работая по одной горке за раз, быстро удалите излишки жидкости и поместите горку в стойку слайда, погруженную в окрашивание тарелки, наполненной дистиллированной водой. Вымойте горки два раза в течение двух минут в дистиллированной воде при комнатной температуре с постоянным возбуждением.
Чтобы начать гибридизацию, нажмите и щелкнуть слайды, чтобы удалить излишки жидкости и поместить их обратно в слайд стойку. Удалите предварительно разогретый зонд ВПЧ из духовки и добавьте примерно четыре капли, чтобы полностью покрыть каждый раздел. Накройте лоток крышкой и вставьте его в духовку на два часа при температуре 40 градусов по Цельсию.
После завершения инкубации, удалить лоток из духовки и удалить слайд стойку. Один слайд в то время, быстро удалить излишки жидкости, и поместите слайд в слайд стойку погружен в окрашивание блюдо заполнено одним х мыть буфер, мыть горки в течение двух минут при комнатной температуре с постоянным возбуждением, и повторить со свежим х мыть буфера. Нажмите и флик, чтобы удалить излишки жидкости из слайдов, и поместите их в слайд стойку снова.
Добавьте приблизительно четыре капли КОМНАТной температуры AMP1 на секцию, чтобы полностью покрыть каждый раздел. Накройте лоток крышкой и вставьте его в духовку на 30 минут при температуре 40 градусов по Цельсию. После удаления лотка из духовки снимите стойку для слайдов.
Работая один слайд в то время, быстро удалить излишки жидкости, и поместите слайд в слайд стойку погружен в окрашивание блюдо заполнено одним х мыть буфер, мытье в течение двух минут при комнатной температуре с постоянным возбуждением, и повторить со свежим х мыть буфера. Раздай одинаковое количество капель каждого раствора DAB-A и DAB-B в трубке соответствующего размера, чтобы сделать приблизительно 120 микролитров субстрата DAB на секцию и вихря. Возьмите каждый слайд, по одному, из слайда стойки, и нажмите и Флик, чтобы удалить избыток жидкости, и поместите его обратно в слайд стойку.
Pipette приблизительно 120 микролитров смеси DAB на каждой секции ткани, убедившись, что разделы покрыты. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, и приступить к counterstaining. Поместите одну каплю монтажной среды на стеклянную рейку, а затем поместите рейки на горки и дайте им высохнуть.
Через несколько часов проведем оценку с помощью оптического микроскопа, описанного в рукописи. Как описано здесь в голове и шее плоскоклеточный рак, наличие коричневого punctiform окрашивания в цитоплазме или в ядрах опухолевых клеток определяется положительный случай. Результаты были разделены на два балла, РНК CISH высокий и низкий балл, как наблюдается с 20x цели.
РНК CISH оценка окрашивания считается низким, когда наблюдается в менее чем 50% опухолевых клеток и охватывает менее 80% поверхности клеток. С другой стороны, РНК CISH оценка высока, когда наблюдается в более чем 50% окрашенных раковых клеток, или с окрашивания поверхности превышает 80% в более чем 30% опухолевых клеток. Никогда не следует позволять слайдам высыхать для гибридизации.
Не забудьте разогреть зонд. Для каждого образца, выполнять положительный и отрицательный контроль для того, чтобы оценить качество РНК.
