تهجين في الموقع كروميجيني في أداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة ذات الصلة بفيروس الورم الحليمي البشري

HPV RNA CISH يسمح الكشف عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري النشط. منذ التهجين في الموقع يستهدف فيروس الورم الحليمي البشري RNA هذه التقنية يسمح التصور من النسخ النشط للفيروس. لديها دقة مكانية دقيقة وأداء تشخيص جيد.

قد يدعم الكشف عن فيروس الورم الحليمي البشري تشخيص العديد من الآفات المرتبطة بـ HPV، مثل سرطان الخلايا الحرشفية الفموية أو البلعومي أو لأورام عنق الرحم. قد يكون لها أيضا تأثير على التكهن. بعد إعداد المخازن المؤقتة والكواشف المضادة للتلوين ، أعد كاشف استرجاع هدف واحد في beaker كبير عن طريق إضافة 70 ملليلتر من كاشف الاسترجاع المستهدف 10x إلى 630 ملليلتر من الماء المقطر.

ضع كوب على لوحة تدفئة مع مُحرك مغناطيسي واغطيه بورق الألومنيوم. تغلي محتوياته في 100 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة مع التأكد من عدم غليه لأكثر من 30 دقيقة. لمنع نشاط البيروكسيديز على الشرائح مع أقسام الأنسجة سابقا deparaffinized ووضعها في رف الشريحة، إضافة أربع إلى ست قطرات، فقط بما يكفي لتغطية العينة، من بيروكسيد الهيدروجين إلى كل شريحة، واحتضان لهم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الشرائح مرتين لمدة دقيقتين في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة. لكسر حدود أنسجة الحمض النووي الريبي في أقسام الأنسجة RNA، أولا إزالة رقائق الألومنيوم من الغليان واحد × TRR باستخدام مخلب، ووقف التحريك. اغمر رف الشريحة ببطء وبعناية فائقة.

غطي كوبه مرة أخرى مع رقائق الألومنيوم، واحتضان لمدة 15 دقيقة. استخدام مخلب لنقل فورا رف الشريحة الساخنة إلى حمام الماء المقطر وغسلها لمدة دقيقتين. غسل الشرائح ثم في الإيثانول الطازجة 100٪ لمدة دقيقتين، والسماح لهم الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.

بعد ذلك، استخدم قلم حاجز مبيد للماء لرسم حاجز حول كل عينة، واتركه يجف لمدة خمس دقائق على الأقل. بالنسبة لعملية الهضم البروتية، ضع الشرائح في علبة الرطوبة التي تسيطر عليها، وأضف ما يقرب من أربع قطرات من Protease Plus لكل عينة. غطي الصينية بغطاء، وادخلها في فرن التهجين لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.

قم بإزالة الصينية من الفرن، وأزل حامل الشريحة. العمل شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي السائل الزائد، ووضع الشريحة في رف الشريحة المغمورة في طبق تلطيخ مليئة الماء المقطر. غسل الشرائح مرتين لمدة دقيقتين في الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات المستمرة.

لبدء التهجين، انقر نقرًا سريعًا على الشرائح لإزالة أي سائل زائد ووضعها مرة أخرى في حامل الشريحة. إزالة مسبار HPV تدفئة مسبقة من الفرن، وإضافة ما يقرب من أربع قطرات لتغطية كل قسم بالكامل. غطي الصينية بالغطاء، وادخلها في الفرن لمدة ساعتين عند درجة حرارة 40 درجة مئوية.

بعد الانتهاء من الحضانة، قم بإزالة الصينية من الفرن وأزل رف الشريحة. شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي السائل الزائد، ووضع الشريحة في رف الشريحة المغمورة في طبق تلطيخ مليئة واحد س غسل العازلة، وغسل الشرائح لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مع التحريض المستمر، وكرر مع واحدة جديدة x غسل العازلة. انقر ونفض الغبار لإزالة أي سائل زائد من الشرائح، ووضعها في رف الشريحة مرة أخرى.

أضف ما يقرب من أربع قطرات من درجة حرارة الغرفة AMP1 لكل قسم لتغطية كل قسم بالكامل. غطي الصينية بالغطاء، وادخلها في الفرن لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية. بعد إزالة الصينية من الفرن، قم بإزالة رف الشريحة.

العمل شريحة واحدة في وقت واحد، وإزالة بسرعة أي سائل الزائدة، ووضع الشريحة في رف الشريحة المغمورة في طبق تلطيخ مليئة واحد س غسل العازلة، وغسل لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مع التحريض المستمر، وكرر مع واحدة جديدة x غسل العازلة. Dispense نفس العدد من قطرات من كل DAB-A و DAB-B حل في أنبوب الحجم المناسب لجعل ما يقرب من 120 ميكرولترات من الركيزة DAB لكل قسم، ودوامة. خذ كل شريحة، واحدة في كل مرة، من رف الشريحة، واضغط ونفض الغبار لإزالة السائل الزائد، ووضعها مرة أخرى في رف الشريحة.

ما يقرب من 120 ميكرولترات من خليط DAB على كل قسم الأنسجة، والتأكد من أن يتم تغطية المقاطع. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، والمضي قدما مع الاحتواء المضاد. ضع قطرة واحدة من متوسط التركيب لكل شريحة زجاجية ، ثم ضع الشرائح على الشرائح واتركها جافة.

بعد بضع ساعات، تابع التقييم باستخدام المجهر البصري كما هو موضح في المخطوطة. كما هو موضح هنا في سرطان الخلايا الحرشفية الرأس والرقبة، وجود البقعة اللونية البني في السيتوبلازم أو في نوى الخلايا السرطانية تعريف حالة إيجابية. تم تقسيم النتائج إلى 20x درجات، RNA CISH درجة عالية ومنخفضة كما لوحظ مع هدف 20x.

ويعتبر رنا CISH درجة تلطيخ منخفضة عندما لوحظ في أقل من 50٪ من الخلايا السرطانية ويغطي أقل من 80٪ من سطح الخلية. من ناحية أخرى، درجة رنا CISH عالية عندما لوحظ في أكثر من 50٪ من الخلايا السرطانية الملطخة، أو مع سطح تلطيخ تتجاوز 80٪ في أكثر من 30٪ من الخلايا السرطانية. لا ينبغي لأحد أن يترك الشرائح تجف للتهجين.

لا تنسى أن تسخين التحقيق. لكل عينة، تنفيذ الرقابة الإيجابية والسلبية من أجل تقييم نوعية الجيش الملكي النيبالي.