この方法は、神経化学的検出のインビボ法を潜在的に強化することができる高い空間および時間的分解能で神経化学的検出を可能にするため、有意である。この技術の主な利点は、それは、神経伝達物質検出の感度と時間的解像度を高めるために迅速で簡単かつ再現可能な方法です。この手順のデモンストレーションは、サヌジャ・モハナラジとポーリーン・ウィネンバーグ(私の研究室の大学院生)です。
まず、炭素繊維材料を個々のストランドに分離し、単一の7マイクロメートル直径の炭素繊維をストランドから引き出します。真空ラインをホウケイ酸ガラスキャピラリーに接続し、炭素繊維をキャピラリーに吸引します。その後、10センチメートルを25センチメートルの段ボールで切断し、電極ホルダーとして機能します。
サポートとして段ボールの周りにペーパータオルをテープで貼り付け、キャピラリーを電極ホルダーに挿入し、垂直キャピラリープーラーで慎重に固定します。ガラスのキャピラリーを電極材料用の細かいテーパーに引っ張って起動するようにキャピラリープーラーを構成します。引っ張りが終了し、加熱コイルが冷却されたら、チューブプル電極を接続する炭素繊維を切断します。
細管の引き手から微小電極を慎重に取り外します。ステレオスコープまたは顕微鏡によって導かれ、鋭い刃または外科用はさみを使用して、各電極の突出した炭素繊維を約100〜150マイクロメートルの長さにトリミングする。次に、25ミリリットルのバイアルで、綿棒を使用して10グラムのエポキシと0.2ミリリットルの硬化剤を混合する。
アセトンで別のバイアルを充填します。各電極について、炭素繊維チップをエポキシに15秒間浸し、アセトンに3秒間浸して余分なエポキシを取り除きます。エポキシ化後、エポキシ電極を125°Cで3時間オーブンで硬化させる。
次に、マイクロマニピュレーターを使用して、0.1モルの塩化カリウム中のクロロアウリン酸の0.5ミリモル溶液に銀銀塩化物参照電極に炭素繊維微電極を配置します。電極を、働く電極として炭素繊維マイクロ電極を使用してポテンショスタットに接続します。電極堆積を行うために、10サイクル/秒あたり50ミリボルトで0.2ボルトからマイナス1ボルトまで電極をスキャンします。
金のコーティングを堆積するためのパラメータを最適化することが重要です。コーティングが多すぎるとノイズや信号の過負荷が発生し、コーティングが少なすぎると神経化学的検出が強化されません。試験の前に、過塩素酸中のドーパミンの10ミリモルストック溶液と脱イオン水中のpH 7.4 PBSベースの緩衝液の約1リットルを調製する。
1マイクロモルドーパミン溶液を作るために10ミリリットルのバッファーにドーパミンストック溶液のピペット1マイクロリットル。次に、炭素繊維マイクロ電極と塩化銀銀参照電極をポテンショスタットに接続します。フローセル装置のヘッドステージで炭素繊維電極と参照電極を固定し、マイクロマニピュレータを使用してフローセルに下げます。
60ミリリットルのPBSバッファーを注射器に引き込みます。フローセルにバッファを充填し、シリンジポンプにシリンジを取り付けます。毎分1ミリリットルの速度でフローセルを通してバッファを流し始めます。
次に、ポテンショスタットを10ヘルツでマイナス0.4ボルトから1.3ボルト、毎秒400ボルトでスキャンするように設定します。マイクロ電極に波形を短時間適用し、オシロスコープを観察し、過負荷を防ぐためにゲインを調整します。マイクロ電極を緩衝液中で10分間平衡させます。
次に、希釈したドーパミン溶液をシリンジに引き込み、フローセルの注入口に接続します。ポテンショスタットの合計実行時間を 30 秒に設定します。測定の記録を開始し、10秒待ってから、0.2ミリリットルのドーパミン溶液をフローセルに注入します。
実行が終了したら、高精細サイクリック・ボルタンメトリー解析ソフトウェアを使用してデータを処理します。マイクロ電極を10分間再平衡化してから、別の試験を行います。テストが終了したら、3ミリリットルの水と3ミリリットルの空気をバッファーと注入ポートに3回注入してフローセルを洗浄します。
被覆炭素繊維を走査型電子顕微鏡で画像化した。金ナノ粒子コーティングの厚さおよび粒子サイズは、電極堆積時間によって制御することができる。20分間の電極堆積は鋭い隆起を伴う厚い金のコーティングを生み出し、5分は薄い均一な金のコーティングを生み出した。
炭素繊維マイクロ電極を被覆した金ナノ粒子は、未改変電極よりもピーク酸化電流が著しく高く、電子移動速度が速い。この金ナノ粒子コーティングは、ドーパミンの溶液中でここで示されるように、電極応答の安定性に有意な影響を及ぼさなかった。裸と金のナノ粒子コーティングされた電極の両方が、金被覆電極の変化の大きさがはるかに大きいスキャン速度の変化に直線的に反応した。
これは、ドーパミン吸収がスキャン速度を介して制御できることを示した.裸と金のナノ粒子コーティング電極の両方が100ナノモルから10マイクロモルのドーパミン濃度の間で直線的に反応した。より高い濃度で漸近曲線が観察された、ドーパミンが電極表面で過飽和であることを示す。
より速い時間スケールで、より高い感受性で神経化学的変化を検出する能力は、神経科学の複雑な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、分析化学、メタボロミクス、および環境科学にも使用されています。学ぶことは簡単ですが、微小電極の作成、修正、テストを行う上で、視覚的な実証は重要です。
この方法の今後の方向性は、特定の神経伝達物質の検出を最適化するために厚さ、サイズ、形状、および形態を考慮して金および他のコーティングの堆積を調整することを含む。研究者は、この技術を試す前に顕微鏡の下で小さな繊維を扱う練習をする必要があります。また, 神経伝達物質のストック溶液は、彼らが使用するので、ヒュームフードで準備する必要があります 1 モル過塩素酸.
