沿岸および海洋生態系は、陸上生態系から硝酸塩を除去するために、貯水池として重要です。水生環境での硝酸塩は、同時に複数のプロセスで消費することができます。脱窒、アナモックス、DNRAなど。
以前の研究では、DNRAが脱窒可能である可能性が示されていますが、脱窒を測定するものと比較してDNRA活性を測定する研究は依然として非常に限られています。当社のプロトコルでは、環境サンプル中の潜在的なDNRA率の測定のための詳細な手順を提供します。我々は、潜在的なDNRA率は、N15ラベルのN15ラベルの硝酸塩添加とのアンモニウム蓄積から計算することができると考えています。
我々の方法の利点は、他の方法と比較して、アンモニウムは、低大気の背景を有する亜酸化窒素に最終的に変換されるということです。また、四重極ガスクロマトグラフィー質量分析装置を介して亜酸化窒素を測定することは賢明ではありません。これは、同位体比質量分析計よりも安価で管理が容易です。
まず、60ミリメートルのPTFEテープを小さなアルミニウム箔の上に置きます。マフル炉で450°Cでガラス繊維フィルターを4時間アッシュします。次に、ガラス繊維フィルターをテープの長い軸の中間点の少し上に置きます。
次に、ガラス繊維フィルターの中央に硫酸1リットル当たり0.9モルの20マイクロリットルを見つけ、フラットエンドスタンプとストレートエンドピンセットを使用してPTFEテープを直ちに折りたたみます。PTFEテープをガラス繊維フィルターの上にひっくり返し、折り畳んでPTFEテープの両側を密封し、ピンセットで端をしっかりと押します。ピンセットを使用して、PTFEテープの開いた端を折り、端を押します。
ピンセットで端をしっかりと押し、ガラス繊維フィルターを押さないでPTFEテープの開いた端を密封します。30ミリグラムの酸化マグネシウムを20ミリリットルガラスバイアルに移し、PTFEエンベロープをバイアルに入れます。前に調製したサンプルまたは標準の5ミリリットルを、酸化マグネシウムおよびPTFEエンベロープを含むバイアルに移します。
そしてすぐに灰色のブチルゴムストッパーでバイアルを閉じます。次に、アルミキャップでバイアルを密封します。暗い状態で摂氏4度で3時間150 RPMでバイアルを振ります。
これに続いて、各バイアルからアルミキャップとブチルゴムストッパーを取り外します。ポイントエンドピンセットを使用して各バイアルからPTFEエンベロープを取り出し、イオン交換水で封筒とピンセットを徹底的に洗い流します。その後、封筒とピンセットを拭き取り紙で拭き取り、封筒を新鮮な拭き取り紙の上に置きます。
平らな終わりでPTFEの封筒を開き、折り畳みステップの逆の順序で尖ったピンセットを終えた。平らな終わりのピンセットを使用して、硫酸が吸収されないはずのガラス繊維フィルターの周辺領域を保持する。そして11ミリメートルのスクリューキャップ試験管にそれを移す。
イオン交換水でピンセットをすすいで拭き取り、拭き取り紙で拭きます。各試験管に1ミリリットルのイオン交換水を加えます。PTFEが並んだスクリューキャップ付きの試験管を閉じ、室温で少なくとも30分間放置して、ガラス繊維フィルターからアンモニウムカチオンを完全に排除します。
これに続いて、スクリューキャップを開き、試験管に以前に調製した過硫酸酸化溶液試薬の2ミリリットルを加え、スクリューキャップでチューブをしっかりと閉じて、以下のステップで損失または汚染を防ぎます。試験管をラックに置き、二重層アルミニウム箔で包み、摂氏121度で1時間直立した位置にオートクレーブします。1リットルのリン酸バッファーあたり滅菌40ミリモルの100ミリリットル、無菌グルコース1リットル当たり30ミリモルの100ミリリットルを混ぜます。
P.クロロラフィスのグリセロールストックをリン酸緩衝グルコース溶液の200ミリリットルに300ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコに加える。そして、1時間の超純粋なヘリウムストリームでパージします。次に、前に調製した歯硝化懸濁液の2ミリリットルを5ミリリットルバイアルに分配する。
グレーのブチルゴムストッパーとアルミニウムクロージャーで各バイアルをキャップします。ヘッドスペースの空気を超純粋なヘリウムに交換し、3分間真空にしてヘリウムを1分間充電します。意図しない空気汚染を避けるために、ヘッドスペースガスの正圧を1.3気圧に設定します。
1ミリリットルの使い捨て注射器を使用して、ブチルゴムストッパーを通してサンプルまたは標準の1ミリリットルを注入する。その後、暗い条件下で、摂氏25度で一晩バイアルをインキュベートします。翌日、1リットル当たり6モルの水酸化ナトリウムを0.3ミリリットル注入して脱窒を止め、ヘッドスペース二酸化炭素を吸収し、それ以外の場合は亜酸化窒素分析を妨害します。
二酸化炭素と亜酸化窒素は同じ分子量を有するため。4極小極GC/MSを改変して、ヘッドスペースガス内の分子量44、45、46の亜酸化窒素の量を決定します。本代表は、2011年の東日本大震災で発生した、気仙沼市と宮城県の月面で発生した塩沼堆積物の窒素トレース実験15件に由来した。
潜伏期間を通して標識アンモニウム濃度の増加は、サブ潮帯および潮間帯に集められたすべての堆積物に対して観察された。DNRAレートは24.8から177の範囲内でした。また、以前の研究で報告された値に匹敵するが、類似した環境から導き出された値よりも高い。
高いDNRA率は、地震前に栽培場として使用されている塩沼によって説明することができる。推測と一致して、サブ潮帯と比較して豊富で有機化合物である潮間帯におけるDNRA率は高かった。当社のプロトコルは、アンモニウム形成およびN15トレース付加を含む代謝経路の分析に広く適用可能である。
