インビトロバス発酵システムを用いて内生生物とヒト腸内細菌叢との相互作用の解析

当社のプロトコルは、高スループットと内生剤とヒト腸内微生物叢の相互作用の迅速なスクリーニングに広く使用することができます。低コストで、ホストの新陳代謝による干渉効果の回避この手順は、診断に使用される可能性があります。

まず、BIF EPSとデンプンを磁気攪拌機の熱湯に個別に溶解し、1リットル当たり8グラムの濃度を両立させます。調製した塩基性培養培地に、VI、BIF EPS溶液を100ミリリットル加えて、培養VI BIF溶液を作る。培養VIデンプン溶液を作るためにデンプン溶液の100ミリリットルを追加します。

炭素源で2つの媒体をオートクレーブし、炭素源を制御しない媒体を摂氏121度で15分間オートクレーブする。彼らは室温に冷却し、干し草とシステインを追加することができます。各培地の5ミリリットルのサブサンプルを培養管に移す。

そして嫌気性のインキュベーターで保管してください。残りのメディアは摂氏4度で保存します。ヒトの便サンプルを調製するには、新鮮な便サンプルの1グラムをガラスビーカーのpH 7で0.1モル嫌気性PBSの10ミリリットルに移します。

その後、スラリーを達成するためにそれを攪拌するためにガラス棒を使用しています。嫌気性チャンバーでは、3つの調製された発酵培地に、濾過された便スラリーの500マイクロリットルを個別に加える。その後、摂氏37度でインキュベートします。

24時間と48時間後、嫌気室に発酵サンプルを2ミリリットル収集します。そして、チャンバーの外の遠心分離機を6000倍Gで、3分間行う。上清を多糖類分解解析および短鎖脂肪酸測定に使用する新しい遠心管に慎重に移します。

遠心分離ペレットを摂氏80度で保存します。各プレコートシリカゲル60 TLCアルミニウム板に発酵上清の0.2マイクロリットルをロードし、広げるために渦巻く。その後、乾燥するために熱気とヘアドライヤーを使用してください。

サンプルプレートの一方の端を20ミリリットルのギ酸に浸します:n-ブタノール:水溶液は、電気泳動がほぼ他方の端まで延びるまで数分間浸します。その後、鉗子でプレートを取り出し、ヘアドライヤーで乾燥させます。その後、オルシノール試薬にプレートを2分間浸して染めます。

そして、再び乾燥します。プレートを120度のベーキングオーブンに移し、3分間加熱します。次に、プレートの写真を撮って、TLCバンドを測定してEPSの劣化を評価します。

SCFA生産に対するEPSの効果を調べるために、発酵した上清の1ミリリットルを2ミリリットルの遠心管に加え、各サンプルに25重量/体積%の25重量/体積%を0.2ミリリットル加えます。溶液を完全に混合する渦。混合物を13,000倍Gで20分間遠心分離する。

その間、120ミリモル酢酸、プロピオン性、酪酸、同位体、バリック、およびイソ球酸の溶液をチューブに調製する。次に、調製した各酸の1ミリリットルを、25重量/体積%のメタリン酸の1.2ミリリットルを含むチューブに加えます。そして、標準的なカクテルとしてガスクロマトグラフィー器具のサンプルボトルにそれらをロードします。

遠心分離機からチューブを取り出し、上清を新鮮なチューブに移します。0.22ミクロンフィルターを搭載したシリンジを使用して、ガスクロマトグラフィー分析のために上澄みを新しいチューブにフィルターします。本研究では、粘膜EPSの産生がPYGプレート上のビフィズス菌ロンガム培養で、72時間の嫌気性インキュベーション後に観察された。

培養用擦り傷の遠心分離、続いてエタノール沈殿および乾燥により、セルロース様EPSの回収が行われた。TLC分析の結果、ヒトの便微小生物によるデンプンの分解速度はBIF EPSよりも速いことが明らかになった。主な座標分析は、培養VI BIFおよび培養VIデンプン群を示し、互いに別々にクラスター化し、EPSおよびデンプンの可用性がヒトの便細菌群を異なって形成することを示す。

効果サイズに関する線形判別分析は、ジェネラコリンゼラ、コプロコッカス、パラバクテロイド、およびロドシュードモナスが培養VIデンプンサンプルよりも培養VI BIFサンプルに有意に豊富であったことを示す。さらに、GC測定は、酢酸、プロピオン性、同位体、酪酸、イソ球酸、およびババラ酸を含む発酵培養物から測定されたSCFAを示す。24時間48時間の発酵後、6つのSCFA濃度のうち5基は類似しており、培養VIBIF、培養VIデンプン、および培養VI群間で統計的に異ならなかった。

しかしながら、培養VIデンプン基よりも培養VIBIF群においてプロプリオン酸濃度が有意に高く、48時間の発酵後であった。この実験を嫌気条件下で行い、固いサンプルをできるだけ早く嫌気性インキュベーターに移します。TLC試薬の一部は危険です。

それらを使用するように注意する必要があります。