血小板は、生化学的および生理学的特性を研究する際に、血液細胞およびタンパク質から解放されるべきである。そこで、マウスの血液から血小板を浄化するプロトコルを開発しました。この技術は、イオヘキソール勾配培地および低速遠心分離を用いて血小板を精製することができ、その結果、他の血液成分から血小板が明確に分離される。
血小板を浄化するために、広孔ピペットチップを使用して、1.5ミリリットルチューブの側面をゆっくりと600マイクロリットルのイオヘキソール勾配培地にゆっくりと重ね合わせます。血小板を分離するためにスイングバケットローターで遠心分離した後、白血球または赤血球層を吸引することなく、新しい広孔ピペットチップを使用して、血小板が豊富な層の大部分と血小板不良層のごく一部を収集します。新しいチューブに血小板サンプルを加え、1ミリリットルのPBSを血小板に加えます。
別の遠心分離を行う前に反転によって血小板を混合します。その後、200マイクロリットルのPBS中のペレットを軽度のピペットで再懸濁する。血小板活性化のために、染色バッファーの100マイクロリットルを含む新しいチューブに6つの血小板に1〜2回10を移します。
0.4ミリモルGPRPペプチドを添加した100マイクロリットルの染色バッファーを含む別のチューブに6つの血小板に1〜2倍10を加えます。GPRPペプチドを用いてチューブにトロンビンを加え、血小板を活性化し、目的の抗体カクテルを両方のチューブに加えます。陽性対照として、0.4ミリモルGPRPペプチドを含むチューブに最大100マイクロリットルの染色バッファーに全血1マイクロリットルを加え、トロンビンを加えてこれらの血小板を活性化する。
陰性対照として、最大100マイクロリットルの染色バッファーに全血1マイクロリットルを加える。その後、両方のコントロールチューブを抗体カクテルで染色します。暗闇の中で室温で30分後、チューブあたり1ミリリットルの新鮮な染色バッファーでサンプルを洗浄します。
新鮮な染色バッファーの300マイクロリットルにペレットを再懸濁します。次に、細胞サンプルを光から保護された個々のフローサイトメトリー分析チューブに移します。血小板をフローサイトメトリーで分析するには、新しい実験を作成し、対数前方散乱対対ドットプロットを生成します。
必要に応じて電圧を調整した後、補正コントロール用の単色染色セルを記録します。ここで、正のコントロールサンプルを実行して、補正とゲートを調整するのに十分なセルを取得します。次に、全血サンプルごとに100,000個の事象を取得して記録し、適切なプロットとゲートを使用してフローサイトメトリーデータを分析します。
血液が徐々に培地に添加された場合、イオヘキソールの勾配媒体と血液サンプルは、チューブ内に2つの別々の層を形成する。遠心分離後、上部のストロー色の層は血漿を含んでいるが、無傷の血液細胞は含たない。第二に、白っぽい、血小板が豊富な層は、血小板の大部分を含む。
第3に、透明層は血小板不良層であり、赤血球および白血球ペレットの真上にある。全血は、対数的な前方散乱対側面散乱ドットプロット上の赤血球、白血球、および血小板の異なる集団を示す。しかし、精製された血小板は、赤または白の血液細胞の無視できる数を持つ明確な集団を示す。
全血サンプルには、精製血小板サンプルにほとんど存在しないTer119陽性赤血球およびCD45陽性の白血球集団が含まれています。未処理の精製血小板は、その安静状態を確認する活性化マーカーをほとんど発現しないのに対し、精製されたトロンビン処理血小板は典型的には71%P-selectin発現を示す。未処理の精製血小板サンプルの顕微鏡評価は、血小板凝集を明らかにしない。
しかし、トロンビンで活性化した後、血小板は強い凝集を示し、実証したように精製後の生存率をさらに確認する。血液サンプルをイオヘキソール培地に注意深く重ね、血小板を採取する際には、血小板の浄化を成功させるために赤血球および白血球層を採取しないように注意深く吸引するようにしてください。この方法は、他の種からの血小板精製にも使用できます。
精製された血小板は、遺伝子発現、活性化、凝集、顆粒放出、および接着試験に使用することができる。
