近年、脳の脳の機能は神経疾患や脳機能に明らかになってきた。したがって、これらの細胞に対する信頼性の高い培養方法の開発が不可欠である。マウス脳のペリサイトの抽出のための私達のプロトコルは、体外研究のための信頼性の高いツールを表し、高純度および細胞収量のペリシテを提供するため。
アヌプリヤ・メヘラとの手順を実証することは、私の研究室の技術者ルーシー・デフックです。特定の病原体を含まない4〜6週齢の雄C57BL/6マウスから無菌乾燥糸状拭きに脳を配置し、湾曲した先端鉗子を使用して小脳、線条体、後頭部神経を除去することから始めます。綿棒を使用して、目に見える髄のすべてを取り除き、脳組織を逆さまにします。
軽い外側のストロークでローブを開き、目に見える血管をすべて取り除きます。その後、15ミリリットルの冷たい洗浄バッファーを含む100ミリメートルのペトリ皿に髄歯を含むペトリ皿に入れ、組織を均質化B.To、脳サンプルをDounce組織グラインダーモルタルチューブに移し、3〜4ミリリットルの洗浄バッファーBをチューブに加える。緩い害虫を使用して組織を55回ミンチし、洗浄バッファーBで害虫を洗い流し、タイトな害虫で組織スラリーを25回ミンチします。
均質化の終わりに、2つの50ミリリットルチューブ間のスラリーを均等にアリコートし、冷たい30%ウシ血清アルブミンデキストランの1.5倍の体積を加える。その後、スラリーを混ぜるためにチューブを激しく振ります。血管分画を単離するために、遠心分離によって細胞を沈降させ、上清を2つの新しい管に移す。
ペレットを洗浄バッファー B に氷の上に保管します。氷上の冷たい洗浄バッファーBの3ミリリットルにペレットを再懸濁します。収穫した上清を遠心分離し、さらにこのステップを繰り返します。
上澄み液を捨ててペレットを3ミリリットルの洗浄バッファーB.に再懸濁させ、プールされた細胞懸濁液の最終容積を新鮮な冷たい洗浄バッファーBで10ミリリットルに持ち込み、さらにペレットの残りの塊が見えないまで10ミリメートルのピペットで細胞を6回解離し、真空フィルターとナイロンメッシュサスペンションを使用します。ペトリ皿にストレーナーを置き、新鮮な洗浄バッファーBでメッシュをクリアし、毛細血管を回復するために削ります。次に、新しいフィルターで 2 回目の濾過を行います。
2つのチューブ間で濾液を均等に分割し、遠心分離によって細胞を収集します。上清を捨てた後、ペレットを酵素と共に温めた洗浄バッファーBを含む単一のチューブにプールし、プレウォームドコラゲナーゼ/ディスパーゼをチューブに加えます。冷たい洗浄バッファーBの30ミリリットルで反応を停止する前に、正確に37°Cで33分間振るテーブル水浴にチューブを置き、遠心分離によって細胞を収集し、慎重に上清を捨てます。
洗浄バッファーB内のペレットを6回迅速に慎重に再懸濁し、再度懸濁液を遠心分離する。上清を捨てた後、ペレットを完全なDMEM培地の18ミリリットルで再懸濁し、6ウェルプレートをコーティングした3つのマトリゲルの9つの井戸に完全なDMEMで2ミリリットルの細胞懸濁液を種付けします。細胞培養液を無菌37°C5%の二酸化炭素インキュベーターに24時間入れてから、各ウェルから破片を慎重に取り除き、新鮮なDMEM培地を加えます。
48時間後、48時間ごとに各ウェルで培地を交換します。細胞が100%合流に達した8日目から10日目に、新しいゼラチンコーティングされた6ウェルプレートにペリサイト培養培地中の細胞を通過させ、さらに6〜7日間細胞培養器に戻し、モニタリングを行う。その後、17日目に再び細胞をペリサイト培地で新しいゼラチンコーティングプレートに分割する。
通路0から2に、内皮細胞とその後の徐々に増加する前皮細胞を同定することができる特定の形態学的特徴がある。通路ゼロ培養では、微細血管から発達する細長い内皮細胞が豊富に存在する。この量は、通過1の後に減少し、通過2の後に不在です。
それどころか、初期培養では四国間細胞としては、四角四方形細胞として現れ、継いで2個ほどに豊富になる。NG2、CD146、およびPDGFRベータの発現の評価は、定量PCR、免疫細胞化学、およびウェスタンブロットによるペリサイト培養の純度を評価するために使用することができる。酵素消化は、プロトコルの成功のための重要なステップです。
酵素濃度とインキュベーション時間を厳重に監視してください。
