私たちは、モナッシュラーキンスプログラムからだけでなく、NHMRC CDFとNHMRCプロジェクト助成金からの財政支援を承認したいと思います。さらに、私たちはビデオを生産する彼らの助けのための彼女の建設的な提案、彼女のサポート、モナッシュFlowcoreチームのエドウィナMcGlinn（特にアダムディンスデール）のためにスーメイリムに感謝したいと思います。

1 [機器の設定/試薬の調製/ジェノ<ol><li> iPS細胞培地の調製：5台の白血病抑制因子を75mlで500ミリリットルノックアウトDMEM培地サプリメントウシ胎児血清（FBS）を5mlのL-グルタミン5mlの非必須アミノ酸、500μlのβ-メルカプトエタノール、5×10（ LIF）。この原稿の文脈で使用される試薬の製品や購入については、物質一覧をご参照ください。 </li><li> MEF培地を準備し、50ミリリットルのFBS、5ミリリットルのL-グルタミン、5ミリリットル非必須アミノ酸と5ミリリットルピルビン酸ナトリウム、500μlのβ-メルカプトエタノールを500ミリリットルDMEM培地サプリメント。 </li><li>凍結培地の準備：10ミリリットルのために、1mlのDMSOとFBSの9ミリリットルを兼ね備えています。 </li><li>右の使用の前に少なくとも10分間吸引をRTでインキュベート、ゼラチンコーティングされた料理はT75フラスコに3〜5ミリリットルの0.1％ブタゼラチン溶液を添加調製します。 </li><li> FACSの標識培地を準備します。10ミリリットルのために、FBSの0.1ミリリットルを含むPBSの9.9ミリリットルを兼ね備えています。 </li><li>実行するRosa26遺伝子m2rtTA遺伝子座について遺伝子型決定PCR：製造業者の説明書に従って、DNAポリメラーゼとの反応を実行します。 oIMR8052：5 &#39;GCG AAG AGT TTG TCC、TCA、ACC 3&#39;、oIMR8545：5&#39;AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 &#39;、oIMR8546：5&#39; GGA GCG修正された3.5 mmで、以下の3のプライマーのMgCl 2 -concentrationを使用してくださいGGA、GAA ATG GAT ATG 3 &#39;。サイクリング条件：3分94℃; （30秒94℃、1分間65°C、1分間72℃）の35サイクル; 2分間72°C; 12℃で保持します。予想製品サイズ：野生型対立遺伝子650 bpおよび変異対立遺伝子340塩基対。 </li><li>コラーゲンStemCa / OKSMの座について遺伝子型決定、PCRを実行します。指示に従って、DNAポリメラーゼの反応を実行します。使用のMgCl 2を2.5mM、以下の3プライマーの-concentration更新日：COL / FRT-B：5 &#39;CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3&#39;、COL / frtA1：5 &#39;GCACAGCATTGCGGACATGC 3&#39;、COL / frtC1：5 &#39;GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 &#39;。サイクリング条件：1分間95℃（30秒、45秒、70℃、94℃）の2サイクル、30サイクル（30秒、45秒、68℃で94℃）の6サイクル（20秒94℃、60℃、1分間）の; 5分間72°C; 12℃で保持します。予想製品サイズ：野生型対立遺伝子のための331 bpおよび変異対立遺伝子のための551 bpの。 </li><li> 4℃で3分間400×gですべての遠心操作を行ってください。 </li></ol>マウス胚線維芽細胞の2世代<ol><li> m2rtTA株の反対の性別のメンバーとOKSM株の動物間の時限交配を行います。母親をカリングし、子宮角を除去することにより、胎生13.5で収穫の胚。子宮角を除去する前に、微生物汚染を回避するために、80％エタノール溶液で腹部スプレー。 </li><li>滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBを10 mlを含む10cmの組織培養皿に子宮角を転送するS）。 （ 図3A、Bを参照）1胚を含む断片に子宮角をカットする滅菌外科グレードのハサミを使用してください。 </li><li>慎重に子宮エンベロープと各胚を取り巻く胚体外膜を除去するために解剖顕微鏡（理想的には、組織培養フード内に配置された）、滅菌ピンセットを使用してください。 10mlのPBSで独立した10cmディッシュに各胚を転送します。 </li><li>胚の頭、手足、尻尾やピンセットで内臓（心臓、肝臓、腸など ） を除去することによって進みます（ 図3Cを参照）。 1.5mlチューブに胚の頭部を転送し、必要に応じて、それが遺伝子型決定のために使用することができるので、ダウンフリーズ。 </li><li>空の10センチメートルプレートに胚の胴体を移し、2分間胚をミンチする2外科のブレードを使用しています。ミンチ胚の上にトリプシン/ EDTA溶液200μlを加え、室温で3〜5分間インキュベートする。さらに2分間のミンチを続け、中にMEF培地の2ミリリットルを追加<html>トリプシンを活性化し、次いで15 mlのチューブに移す。 </li><li>さらに機械的に穏やかにピペッティングすることによって組織を解離千μlのピペットを使用してください。ゼラチンコート10cmディッシュに移し、MEF培地の追加の10ミリリットルを追加します。注：両方の正常酸素および低酸素インキュベーターは培養に使用することができ、詳細については説明を参照してください。 </li><li> 24〜48時間後、プレートを密にしたMEFで覆われている必要があります。 </li><li>あるいは、細胞は、その後さらに増殖またはダウン凍結することができる。細胞の凍結のために、培養培地を除去し、3ミリリットルのトリプシン/ EDTA溶液を用いてメディアやオーバーレイの痕跡を除去するために10ミリリットルのPBSで皿をすすぐ。 37℃で3〜5分間インキュベートする1​​5mlの遠心分離チューブにMEFメディア転送を5ml加えることによってトリプシン消化を不活性化する。スピンダウンし、メディアの凍結3mlにペレットを再懸濁します。 3クライオバイアルに移し、細胞凍結容器内にダウンして凍結する。 </li></ol> MEFは3。リプログラミングove_content &quot;&gt;注記：4℃で5分間、200×gでの遠心分離により細胞をペレット化し、再プログラミングのために正常酸素組織培養インキュベーターを使用することが低酸素条件下でのMEFを導出し、展開することが有益であることができる（5％酸素、詳細については説明を参照してください。 ）。 <ol><li>迅速水浴（37℃）で低継代クライオバイアル（P0-P1、2-3ミオ細胞）を解凍し、予め温めておいたMEF培地10mlのチューブに内容物を移す。ペレット細胞は、12ミリリットルの新鮮MEF培地中で再懸濁は、ゼラチンコートT75培養容器に移すと、細胞は先に進む前に24〜48時間で回復することができます。注：MEFにも直接導出して用いることができる。 </li><li>培養培地を除去した後、トリプシン/ EDTA溶液（37℃で3〜5分間、3ml）で重ねることによってPBSとcellularizeでのMEFを洗う。 MEF培地を5mlを添加することによりトリプシンをクエンチし、さらに10 mlピペットで穏やかに混合することによって細胞を解離する。血球計数器を用いて細胞数を決定します。 </li><li> reprogra用mming実験、6.7×10 3細胞/ cm 2の密度でゼラチンコートT75フラスコ上にシードのMEF（〜フラスコあたり0.5澪細胞）2μg/ mlのドキシサイクリンを含むIPSC媒体中。各時点での約2澪書き換え中間体を得るために、播種の勧告について、表1を参照してください。注：再プログラミングがドキシサイクリン（2μg/ ml）をを添加して開始されるメディアを補足し</li><li>最初の6日間、新鮮なドキシサイクリンを補足IPSCメディア（T75フラスコあたりのメディアの12ミリリットル）で一日おきにメディアを交換。高い細胞数がある場合は、この点を超えると、日常的にメディアを更新する。メディアの変更のみ隔日に行うことができれば培養液量を倍増。 </li><li>必要な時間点で収穫書き換え中間体：のために（3 mlでPBS適切な体積（T75フラスコのため10ml）でリンスし、トリプシン-EDTA溶液でオーバーレイし、培地を除去することにより（提案日3、6、9、12） T75フラスコ）。培養する37°Cで3〜5分間、穏やかにピペッティングに続いIPSC培地を5ml加えることによりクエンチした。 </li><li>血球計数器で細胞懸濁液を数える（上記参照）、遠心分離によってペレット、トリプシンの痕跡を除去するために10mlのPBSで上清再懸濁細胞を吸引除去する。再び細胞をペレット吸引上清および再プログラミング中間体を単離するためにステップ4.1に進みます。注：再プログラミングを受けている細胞は、凍結保存され、後の段階で、FACS分離のために解凍することができます。 </li><li>完全に再プログラムされたiPS文化を確立するために、さらに4-7日間のdoxフリーIPSC培地中で細胞を増殖させる。注：正常に再プログラムする文化が一日12によるコロニーが多数含まれています（ 図4を参照）。この間、まだOKSM発現を必要と異常なiPS細胞が消えます。 </li><li>代わりに、残りの完全に再プログラムされたiPS文化を伝播するために：最初は、15×10 3細胞/ cm 2の密度で照射されたMEFをシード</s&gt;アップT75コーティングされたゼラチンの上にIPSCメディア12mlに1日以上前の実験と6時間後にフラスコ。 </li><li>次に、培地を除去し、PBS 10mlでT75フラスコをすすぎ、トリプシン-EDTA溶液3mlでオーバーレイし、37℃で3〜5分間インキュベートすることによりcellularize iPS細胞培養物。 、穏やかに混合しIPSCメディアの5ミリリットルを添加することにより、トリプシンをクエンチ15ミリリットルコニカルチューブに移し、スピンダウンした後、10ミリリットルのiPS培地に再懸濁。 </li><li>照射したMEF（T75フラスコ）にこの細胞懸濁液を500μlを移し、培養物は4〜5日間成長させる。注：樹立されたiPS培養物は、凍結保存または実験のために使用することができる。クローン細胞株は、解剖顕微鏡の下で22の個別IPSCコロニーをピッキングすることによって導出することができる。 </li><li> MEFは2.8で説明したようにクライオコンフルエントIPSC文化を保持します。 </li></ol> 4。抗体標識<ol><li>で、第3節で調製した再プログラミング培養物の再懸濁細胞ペレット、抗体を補充し、FACSラベリングメディア（1抗Thy-1.2パシフィックブルー：400、抗SSEA-1ビオチン1：400および抗EpCAM FITC 1：400）。 500万細胞あたりを補足標識ミックスを200μlを使用し、氷上でインキュベートする。 </li><li> 10分後、穏やかに細胞を再懸濁し、氷上でさらに10分間インキュベートし、チューブをタップします。チューブあたりの冷PBS 10ミリリットルを加え、スピンダウン。 </li><li> 500万細胞あたり：各チューブについて（200 1）1μlのストレプトアビジンPeCy7補充したラベルメディア200μlの準備に染色する。細胞がペレット化したら、慎重にストレプトアビジンPeCy7補充したラベリングメディアの適切な容量の上清と再懸濁を吸引。 </li><li> 、再懸濁、氷上でさらに10分間インキュベート、チューブあたりの冷PBSを10mlを追加し、スピンダウンし、上清を吸引除去しをタップ、10分間氷上で細胞を保管してください。 </li><li>約1×10 7細胞/ mlのヨウ化プロピジウム（PI）（2μg/ ml）を補充した、標識培地中で再懸濁し、細胞ペレット。 70μmのストレーナーにサスペンションを通過させることによって、細胞塊を除去します。適切なFACSチューブに細胞を移し、氷上に保管してください。 </li><li>個別の抗体（抗Thy-1.2、抗SSEA-1および抗EpCAM）付きの独立したサンプルを準備します。注：これらの分析に使用される三つのチャネルにおける色補正を行うために必要とされる。さらに、非標識細胞ソーティングのための電圧およびゲートを設定するために必要とされる。理想的には、iPS細胞は、補償のために使用されます。、照射MEF上に維持さ0.5〜1×10 6 iPS細胞のストックを、液体窒素中で凍結バイアルに保存されます。 MEFはの存在は汝-1.2チャンネルの信号を得ることが不可欠である。 </li><li> MEFは（セクション3）について記載したようにiPS細胞のクライ​​オバイアルを解凍する。遠心分離後、標識バッファー800μlのこのサンプルの200μl中に再懸濁細胞を、標識されていないコントロールとして確保されている。 </li><li>補償コントロールとして残りの細胞を使用してください。 3 15ミリリットルチューブ間のセルを分割し、抗体を追加次のように：パシフィックブルー補償制御を：抗Thy-1.2パシフィックブルー抗体の0.5μlを添加する。 FITC補償管：抗EpCAM-FITC抗体の0.5μlを添加する。 PE-Cy7の補償制御：抗SSEA-1-ビオチン抗体0.5μlの。 </li><li> 、氷上で10分間細胞 - 抗体のサンプルをキープタップして混合し、氷上で10分間インキュベートする。 </li><li> 10ミリリットルの冷PBSで洗浄サンプルは、未結合の抗体を除去し、細胞をスピンダウンし、上清を吸引する。 FACSラベリングメディア200μlの再懸濁細胞ペレット。 </li><li>抗SSEA-1-ビオチン標識された試料については、ストレプトアビジンPeCy7コンジュゲート（200μlの細胞あたり1μl）を追加します。一次抗体（SSEA-1-ビオチン）について記載したラベル細胞。 </li><li> 70μmのストレーナーに標識されていないコントロールを含むすべてのサンプルをパスし、PI（2μg/ mlの）を追加します。 FACSチューブに細胞を移し、必要になるまで氷上に保つ。 </li></ol>中間体の5 FACS単離注：細胞を405nm、488 nmおよび560 nmの励起レーザーおよび100μmのノズルを蛍光活性化セルソーターを使用して並べ替えられています。 <ol><li>細胞集団が適切に可視化されるように、前方および側方散乱のための電圧を設定する。破片を排除するために、図5Aに示されるように、セルの周囲にゲートを描画します。注：セルソーターの電圧の正しいセットアップが複雑で、経験豊富なFACSオペレータを必要とすることができます。 </li><li> FSC面積に対する利用前方散乱（FSC）高さは、骨材（ 図5B）を除外します。 </li><li> PI陰性の生細胞（ 図5C）上におけるゲートへのFSCに対するPIチャネルを可視化。 </li><li> PB、FITC / GFP、PE-Cy7での蛍光のチャネルの電圧を調整するために非標識細胞を使用してください。理想的には、それぞれのチャネルの下端に細胞集団を配置。 </li><li>リプログラミングカルトサブ画分に図6A、Bに示すように、非標識コントロール細胞とゲートを設定します3日目、6にURESと9集団：SSEA-1〜/のThy-1.2 +細胞; SSEA-1〜/汝-1.2-細胞;そして再プログラミングは、SSEA-1 + /のThy-1.2〜細胞を仲介。 </li><li>さらにFITCブロットに対するPE-Cy7のを使用して9日目SSEA-1 + /のThy-1.2〜分数を分割。 SSeが-A1 + /のEpCAM +細胞およびSSEA-1 + / Epcam-細胞の周りにゲートを描きます。 図6C、Dに示すように、非標識コントロール細胞とゲートを設定します。 </li><li> iPS細胞培地（1-2）で洗浄したプレフィル適切な採血管希望亜集団をソートする前に（9/12日の文化やiPS細胞6 /日3日目/日、のMEFのための代表的なFACSプロファイルについては、図7を参照）。 </li><li> FACSソーティングプロトコールを製造しているに応じて実行します。 </li><li> FACS分離した後、分子プロファイリング（RNA /タンパク質抽出、クロマチン免疫沈降法は、DNA methylome解析など）にセルを送信してください。あるいは、さまざまな細胞画分を培養することができる。 </li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

成功したiPS細胞へのMEFを再プログラムし、多量に再プログラミング中間体を精製するためには、全体の効率に影響を与える要因を認識することが不可欠である。特にFBSのバッチが有害な影響を持つことができたiPSメディアを補充するために使用される。一般肯定的な経験では胚性幹（ES）細胞修飾FBSが、安価な代替を特定するかもしれない、さまざまなベンダーからの血清のバッチテストを行った。 初期化効率への影響は、MEFを15,20の遺伝子型であるもう一つの要因。 OKSMとm2rtTA座の両方のマウスのヘテロ接合（HET）から派生したMEFますがすることは、より高いリプログラミング効率の一方または両方の遺伝子座の結果でhomozygousityを再プログラムです。実際、OKSMとm2rtTA交配の子孫から得られたMEFは、次の順序（OKSM / m2rtTA）におけるリプログラミング効率の向上を示しています。HET / HET &lt;ホモ/ヘタ&lt;HET /ホモ&lt;ホモ/ホモ（ 表1に示した数字はHET / HET動物のためであることに注意してください）。まれに男性のホモ/ホモ動物が識別された、複数のm2rtTA雌と交配ハーレムを設定することができます。これらの交雑からのすべての子孫は、それぞれ、OKSM / m2rtTA座について/ホモHETされます。また、同腹の急速なジェノタイピングは、繁殖のために若いマウス（生後6-15週）を使用する場合、より大きな仔が得られるようにお勧めします。 また、再プログラミングのための低継代のMEFを使用すると、23を強調している。 MEFには、正常酸素組織培養インキュベーターで導出し、増殖させた場合には、私たちを強く実験者のMEFの導出および拡張のための低酸素インキュベーター（5％酸素）にアクセスできる場合にのみ、しかし、通路2にこれらの細胞を使用することをお勧めします、 3という高い継代数はまだ良い結果23が得られます。 ケースで実験者は再プログラミングに関連する問題が発生した、<html>概説したように、最も可能性の高い説明は、doxの添加、誤ったマウスの遺伝子型またはiPS細胞の生成のために助長されていませんFBSの使用時の高い継代数である。しかし、まれに私たちはMEFをさえ理想的な条件の下で再プログラムすることができませんでしたことを観察した。これらのケースではm2rtTAのオープンリーディングフレーム内の自発的なデノボ削除は根本的な理由であると同定された。 この方法は成功裏に磁気細胞分離（MACS）を介して、SSEA-1 +中間体を抽出するようにした。 MACSを使用して明確な時間という利点があるが、SSEA-1 +細胞集団 &#39;純度は、細胞がもたらす可能性があり宛ての実験のタイプに応じて80〜90％ではなく、95％以上に低減される問題。したがって、このオプションは、純度および/またはSSEA-1 + / +のEpCAMおよびSSEA-1 + / Epcam-細胞への分画、それらを高めるために、FACS続いSSEA-1 +細胞を濃縮するためにMacを使用することです。 概説したプロトコルおよびマウスモデルによって生成されたiPS細胞が多能性であると効果的キメラ動物15,20の全ての組織に寄与することが示されているが&quot;&gt;、完全に四倍体相補性を介してこれらのiPS細胞からなる胚を産生する能力の低下があった24を示した。いるDlk-DIO3遺伝子クラスターにおける異常なメチル化パターンは、根底にある原因24として同定されているが、再プログラミング中のメディアへの50μg/ mlの濃度のアスコルビン酸の添加は、四倍体相補コンピiPS細胞24を生成する。代替再プログラム可能なマウスモデルは、異なる化学量論での初期化因子であっても、アスコルビン酸処理25が存在しない場合に四倍有能なiPS細胞を作り出すことができる発現するように操作ますのでご注意ください。しかし、私たちの手で、この株書き換えでかなり低い周波数からの細胞を比較本明細書中で使用されるマウスモードへlである。 この原稿に記載された方法論は、人口の耐火バルクから再プログラミング中間体の分離を可能にし、 たとえば解剖とプロファイリングのための未分画の人口を使用するので、以前の制限を削除し、再プログラミング過程を理解するための貴重なツール（と見なされるべきである難治性細胞からの高い信号ノイズ）。本明細書に記載の抗体の組合せは、しかし、それは付加的な細胞表面マーカーは、より高い純度の中間体を得ることができるようになり、将来的に発見される可能性があり、高純度でのマウス細胞からの中間体の単離を可能にする。 SSEA-1の発現は、ヒトの人工多能性幹細胞の特徴ではなく、そのようなこのプロトコルなどのヒト由来の細胞を再プログラミングで使用することはできませんのでご注意ください。結論として、一度説明した方法を用いて単離し、再プログラミングの中間体は、発現プロフィリンを含む分子分析のために使用することができるgでクロマチン免疫沈降、methylome分析、およびタンパク質アッセイ。

胚性幹（ES）細胞は、胚盤胞期胚1の内部細胞塊から誘導される。適切な培養条件の下で、彼らは自己再生および多能性のまま。 2006年に山中らは、成熟した細胞は、転写の強制発現によって、いわゆる人工多能性幹（iPS）細胞に因子再プログラムすることができることを実証したOct-4の、KLF-4、SOX-2、c-Mycの（OKSM）2。 iPS細胞は、ES細胞と同様に、身体の全ての細胞型を生じさせることができる、しかし、それらはES細胞3の生成を取り巻く倫理的制約を含まない。さらに、iPS細胞は、パーソナライズされた再生医療の約束を運び、4,5ーをスクリーニングする疾患モデルのようなアプリケーションのために、そしてインビトロ薬剤に多大な可能性を秘めています。この可能性を満たすための技術を再プログラムするためには、核初期化の基本的なメカニズムは完全に理解される必要がある。しかし、努力は再プログラミングパットを解剖するhway細胞のごく少数（0.1〜1％）を再プログラムするという事実によって妨げられてきた。首尾よく再プログラミング線維芽細胞は、再プログラミング、内因性コア多能性ネットワーク11〜14の活性化の最終段階における上皮の移行6-10に、間葉系と、を含むイベントの明確な一連を受けることが報告されている。私たちは、他12,13,15-17は最近、難治性バルク集団から希少な中間体の分離を可能にする細胞表面マーカーのセットを同定した。リプログラミングのマウス胚線維芽細胞（MEFが）2週間にわたる再プログラミング過程の間に15のThy-1.2、SSEA1および（とりわけ）EpCAMの発現の変化を受ける。早期のMEFのサブセットを再プログラミング中の線維芽細胞の同一マーカー（のThy-1.2）の発現をダウンレギュレートした後、多能性関連マーカーSSEA-1 を発現する12始める。再プログラミングSSEA1陽性細胞の最終段階の間、reactivそのようなOct-4の10-13,15などの内因性多能性遺伝子を食べました。この最後の遷移は、検出可能なEpCAMの発現は（ 図1参照）以降の段階PECAM 15による細胞表面上にマークされている。最近、オマリーらは、再プログラミング中間体の同定のためのThy-1.2およびSSEA-1の代替または相補としてCD44およびICAM1の使用を報告した。私たちは、以前に、FACSは、これらの細胞表面マーカー15,18に基づいて0日目、3日目、6日目、9日目と12日目のリプログラミング培養からの再プログラミングの中間体だけでなく、から樹立されたiPS細胞株を抽出した。後述の再プログラミング·システムおよび条件については、私たちは、集団が均質で、静かであるが、特定された中間集団における不均一性のある程度があることを単一細胞レベルで示されている。これは、これらの集団内の細胞のサブセットのみがそれぞれの次の駅に進行することができることに留意すべきである再プログラミングプロセスの葛と広く15,19以前に特徴付けられた異なる効率でiPS細胞コロニーを生じさせること。また、これらの集団の再プログラミング効率は再メッキおよび培養条件にも同様異なります。実験の再現性を向上させるために、私たちは、Rosa26遺伝子座およびドキシサイクリン応答性プロモーター20,21の制御下のポリシストロニックOKSMカセットの制御下で転写トランス（m2rtTA）を発現するように操作された再プログラム可能なマウス系統を使用しています。このマウスモデルを使用すること、すなわち 、ウイルス挿入物の組み込み部位の数と位置のセル変動性細胞と異種の出発集団をiPS細胞の生成の伝統的なウイルス法の望ましくない副作用を回避する。ジャクソン研究所のホモ接合創始動物として利用可能な2つのトランスジェニックマウス系統（OKSM、m2rtTA）は、reprograを確立するために交配されなければならないmmableマウスモデル（ 図2参照）。本稿では、MEFのを導出iPS細胞を生成し、そしてFACSによって変換プロセスのさまざまな段階での再プログラミングの中間体を単離する方法を詳細に説明する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti-mouse CD90.2 (Thy1.2) Pacific Blue&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">48-0902-82&#160;</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti-Human/Mouse SSEA-1 Biotin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">13-8813&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Streptavidin PE-Cy 7&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">25-4317-82&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Anti- Mouse CD326(Epcam) Fitc&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">eBioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">48-5791-82&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11360-070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11140-050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td dir="LTR" height="25" style="height:25px;width:212px;">Embryonic Stem Cell qualified Foetal Bovine Serum (FBS)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10439024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Trypsin-EDTA (0.25%)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">25200-056&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">GlutaMAX</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">35050-070&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">&#946;-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">21985-023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DMSO (Dimethyl Sulfoxide)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">D8418&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Propidium Iodide solution (PI)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">P4864-10ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Gelatine from porcine skin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">G1890&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Doxycyclin hyclate&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">33429-100MG-R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Leukemia Inhibitory Factor (LIF)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Millipore&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">ESG1107&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">11960-044&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">DPBS (Dulbecco s phosphate buffer saline)&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">14190-144&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10829-018&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Irradiated MEFs&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">S1520-100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">75-cm2 Tissue culture flasks&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">15-ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">50-ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Disposable surgical blades&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Disposable surgical blades&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Cryogenic vials&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Corning/BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">70 &#181;m Cell strainer&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">BD Bioscience&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:212px;">Taq DNA Polymerase&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:191px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:171px;">10342-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell surface marker mediated purification of ips cell intermediates from a reprogrammable mouse model

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of the body and consequently have vast potential for regenerative medicine applications. Traditionally iPS cells are generated by viral introduction of transcription factors Oct-4, Klf-4, Sox-2, and c-Myc (OKSM) into fibroblasts. However, reprogramming is an inefficient process with only 0.1-1% of cells reverting towards a pluripotent state, making it difficult to study the reprogramming mechanism. A proven methodology that has allowed the study of the reprogramming process is to separate the rare intermediates of the reaction from the refractory bulk population. In the case of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we and others have previously shown that reprogramming cells undergo a distinct series of changes in the expression profile of cell surface markers which can be used for the separation of these cells. During the early stages of OKSM expression successfully reprogramming cells lose fibroblast identity marker Thy-1.2 and up-regulate pluripotency associated marker Ssea-1. The final transition of a subset of Ssea-1 positive cells towards the pluripotent state is marked by the expression of Epcam during the late stages of reprogramming. Here we provide a detailed description of the methodology used to isolate reprogramming intermediates from cultures of reprogramming MEFs. In order to increase experimental reproducibility we use a reprogrammable mouse strain that has been engineered to express a transcriptional transactivator (m2rtTA) under control of the Rosa26 locus and OKSM under control of a doxycycline responsive promoter. Cells isolated from these mice are isogenic and express OKSM homogenously upon addition of doxycycline. We describe in detail the establishment of the reprogrammable mice, the derivation of MEFs, and the subsequent isolation of intermediates during reprogramming into iPS cells via fluorescent activated cells sorting (FACS).

E13.5マウス胚の解剖、解離、およびめっき後、10cmディッシュは、約1〜2日でコンフルエントに達すると予想される。培養物が適切に細胞化されていない組織のいくつかの接着性部分を含むように、この段階では、それは正常です。これらは、継代後に消えます。 ドキシサイクリン誘導時には、再プログラミングMEFを明確な形態​​学的変化を受ける。 6日目の周囲には、初期のコロニーのようなパッチは、（ 図4C）を出現し始める必要があります。これらには、（ 図4D、E参照 ）、さらに文化の上にサイズが成長していきます。優れた再プログラミング実験は当初、5×10 5細胞（ 図4E）を播種したT75あたり&gt; 500コロニーを生じるはずである。樹立されたiPS培養は、特徴的なドーム形のコロニーを有し、主に分化した細胞（ 図4F）を欠いている必要があります。のiPS cultuの時折、追加の継代解像度は、未分化/部分的に再プログラムされた細胞を除去するために必要な場合があります。細胞のコンフルエントなフラスコを照射したMEFのフィーダー層上に1:10の比率で分割することができる。 上述したように、再プログラミングの間の形態学的および分子的変化のThy-1.2は、SSEA-1、および最終的にEPCAM（ 図7A-Fを参照）のためのFACSプロファイルの変化によって反映される。 MEFはは汝-1.2用に主に正であり、他のマーカーについて陰性ながら、以前に12,15に報告されたように、3日目の培養物はすでに顕著に違って見える。細胞の大部分は、下方制御するために始めているのThy-1.2の発現およびこれらのThy-1.2陰性細胞の非常に小さなサブセットは、SSEA-1、この時点での中間の実際の再プログラミングのためにポジティブになっている。 SSEA-1 + /のThy-1.2〜の割合が通常viabl 1〜10％の間の範囲内にあるように目から3文化を抽出することができるリプログラミングの中間体の数は非常に予測できません電子セル。日6,9 SSEA-1 +細胞の増加した割合を上、通常、ウェル10％を超えて、検出することができる。 12日目の周りにSSEA-1陽性細胞のサブセットはまた、EpCAMのための陽性標識することを検出することができる。可変であり、通常、すべての生細胞のわずか2〜4％の範囲であるSSEA-1.2 + /のEpCAM +細胞のパーセンテージとして12日目の培養物は、3日目の培養物と同様に、中間体の精製におけるボトルネックを表す。 表1に示した再プログラミング中間体の予想される数は、粗い近似として機能します。設立善意のiPS細胞培養は、SSEA-1およびEpCAMを強陽性となります。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig1highres.jpg" width="500" /> 再プログラミング経路の間に、図1の表面マーカーの変更：線維芽細胞識別マーカーのThy-1.2のダウンレギュレーションは、のアップレギュレーションが続いているSSEA-1。多能性状態に向かってSSEA-1陽性細胞のサブセットの遷移は、12日目の周りのEpCAMの買収によって示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig2highres.jpg" width="500" /> 図2の再プログラム可能なマウスモデルの概略図が：。m2rtTA発現は遍在的に活性なRosa26遺伝子座の制御下にあるドキシサイクリンの存在下で（DOX）はm2rtTAタンパク質はコラーゲン1a1は少なくともテトラサイクリン依存性プロモーター（tetOP）に結合する（COL1A1） 4因子カセットの発現をもたらす遺伝子座。二シストロン性カセットは、内部リボソーム侵入部位（IRES）によって連結されている。 10月-4 / KLF-4およびSox-2 / c-Mycのためのオープンリーディングフレームは麩です<html>それぞれ、自己切断F2AとE2A配列によってsedの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig3highres.jpg" width="500" /> 図3胚解剖：（A）転送子宮角1胚を含む断片に切断10mlのPBSおよび（B）を充填した10cmディッシュに。 （C）胚体外組織から胚を解放し、頭、手足、尻尾や内臓を取り除く鉗子を使用しては。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> レ/ ftp_upload / 51728 / 51728fig4highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 再プログラミング中の図4。形態学的変化。コロニーのようなパッチは日目以降6から培養中で明らかとなる。善意の性IPSCは、ドーム型の形状、形態によって特徴づけられる。 （A）0日目/ MEFを、（B）3日目、（C）6日目、（D）9日目、（E）、12日目、（F）iPS細胞培養物。スケールバー：200μmの<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig5highres.jpg" width="500" /> 図5の基本的なFACSのセットアップ。（A）は前方散乱エリアブロット対側方散乱で破片を除外します。 （B）前方散乱ハイブロットに対する前方散乱エリアを持つ単一の細胞集団にゲーティングすることによって非破片から凝集体を除外します。 （C）は、ブロット前方散乱エリアに対するPIチャンネルとPIの低いイベントにゲーティングすることによって、単一の細胞集団から死細胞を除外します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig6highres.jpg" width="500" /> 図6ゲー。（A、B）のThy-1.2 + / SSEA-1〜細胞のThy-1.2〜/ SSEA-1〜細胞とのThy-1.2〜/ SSEA-1 +のためのゲートを設定し、非標識対照細胞を使用した細胞。 （C）のEpCAM陽性および陰性細胞のEpCAMのためにゲートを設定するには、非標識対照細胞を使用してください。 + /のThy-1.2〜細胞を分離することができるSSEA-1（D）正と負のEpCAM集団へのEpCAMへ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51728/51728fig7highres.jpg" width="500" /> 再プログラミングプロセスのさまざまな段階におけるSSEA-1 FACSブロットに対する図7のThy-1.2（A）0日目/ MEFを、（B）3日目、（C）6日目、（D）9日目、（E）日12、（F）iPS細胞培養物。 表1推奨播種密度、フラスコ番号とOKSMとm2rtTAための胚ヘテロ接合のP1のMEFのための期待される成果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51728/51728fig7large.jpg" target="_blank">時間をクリックして下さい</a>この図の拡大版を表示するには、ERE。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>デイ</td><td> 0日目に播種したT75フラスコの数</td><td> FACS後のSSEA1 +細胞の総数</td><td> FACS後のSSEA1 + / EPCAM +細胞の総数</td></tr><tr><td> 3 </td><td> 8 </td><td> 200万</td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 4 </td><td> 200万</td><td></td></tr><tr><td> 9 </td><td> 4 </td><td> 200万</td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 10 </td><td>千万</td><td> 200万</td></tr></tbody></table>

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Cell Surface Marker Mediated Purification of iPS Cell Intermediates from a Reprogrammable Mouse Model

Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam.

リプログラマブルマウスモデルからのiPS細胞の中間体の精製を媒介細胞表面マーカー

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.2K ビュー.  Monash University. Mouse embryonic fibroblast can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells at low efficiency by the forced expression of transcription factors Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. The rare intermediates of the reprogramming reaction are FACS isolated via labeling with antibodies against cell surface makers Thy-1.2, Ssea-1, and Epcam. 

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Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

生物学

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

低親和性細胞外受容体 - リガンド相互作用の検出のためのスケーラブルな親和性ベースの細胞外相互作用のスクリーニング（AVEXIS）

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

ヒトiPS細胞のマイクロRNA発現プロファイル、IPから派生網膜色素上皮、および胎児の網膜色素上皮

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

マウス網膜色素上皮からの一次電池文化

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy to use and widely utilized by laboratories analyzing the adipogenic potential of mesenchymal cells. However, they are not specific to changes in gene transcription. We have developed a gene-specific differentiation assay to analyze when a mesenchymal cell has switched its fate to an adipogenic lineage. Immuno-labelling against fatty acid binding protein-4 (FABP4), a lineage-specific marker of adipogenic differentiation, enabled visualization and quantification of differentiated cells. The ability to quantify adipogenic differentiation potential of mesenchymal cells in a 96 well microplate format has promising implications for a number of applications. Hundreds of clinical trials involve the use of adult mesenchymal stromal cells and it is currently difficult to correlate therapeutic outcomes within and especially between such clinical trials. This simple high-throughput FABP4 assay provides a quantitative assay for assessing the differentiation potential of patient-derived cells and is a robust tool for comparing different isolation and expansion methods. This is particularly important given the increasing recognition of the heterogeneity of the cells being administered to patients in mesenchymal cell products. The assay also has potential utility in high throughput drug screening, particularly in obesity and pre-diabetes research.

Traditional methods of assessing adipogenic differentiation are cheap and easy to use, but are not specific to changes in gene expression. We have developed an assay to quantify mesenchymal cell differentiation into mature adipocytes using a lineage specific marker. This assay has diverse applications across basic research and clinical medicine.

可視化と系統特異的マーカーと間葉系細胞脂肪細胞の微分の潜在性の定量化

Several dyes are currently available for use in detecting differentiation of mesenchymal cells into adipocytes. Dyes, such as Oil Red O, are cheap, easy ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

腸の部分的な閉塞のマウス モデル

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...