成人人間の脳からの短期自由浮遊スライス培養

我々は、切除脳外科手術に提出された生きているヒトドナーから採取された脳組織から自由に浮遊スライス培養を準備するためのプロトコルを提示する。この培養は、生化学的および細胞生物学のアッセイまたは免疫細胞化学を行うのもよい。関連する脳疾患における神経変性の根底にあるメカニズムの解明に寄与することが期待される。

この技術の主な利点は、膜挿入物を使用して古典的なスライス培養プロトコルに代わる、よりシンプルで費用対効果の高い方法です。全体的なプロトコルは複雑ではありませんが、髄液の除去、ビブラートメ試料ディスクへの組織の接着、免疫組織化学の切除などのいくつかのステップが、視覚的に実証されたときに最もよく理解されます。この手順のデモンストレーションを手伝うのは、卒業生であるニール・メンデスとグラウシア・アルメディアと、もう一人の卒業生であるジョヴァンナ・ノゲイラです。

この手順を開始するには、氷のバケツに塩を加えます。スライス溶液をこのバケットに移し、使用前に少なくとも20分間、カルボゲン混合物バブリングの下で休ませます。次に、約2センチメートル×2センチメートル×2センチメートルの3%アガロースのブロックを準備します。

スーパーは、スライス中に組織サンプルに追加の機械的サポートを作成するために、ビブラートメ標本ディスクにアガロースブロックを接着します。ビブラートオームでは、断面の厚さを200マイクロメートル、振動周波数を100ヘルツに設定し、毎秒0.5~1.0ミリメートルのスライス速度を選択します。その後、ビブラートメバッファートレイをビブラートメベースにロックし、スライス溶液とサンプルを受け取る前に冷蔵し、スライス手順全体を通して冷蔵保つために氷を追加します。

まず、輸送中のサンプル冷却用の輸送液と氷を含む輸送船と輸送容器に接続されたシリコーンチューブに接続されたガス出力を制御する圧力フラックスバルブに接続されたカルボゲン混合物を含む携帯用ガスボンベを設置する。テキストプロトコルで概説されているように、標本と輸送を収集し、輸送します。スライス溶液を含むペトリ皿に標本を移します。

細かい外科用具を使用して、残りの髄をできるだけ慎重に取り除いてください。実験計画の特定の特性を持つスライスを製造するための最良の標本の向きを選択し、数24メスの刃を使用して、試料ディスクに接着されるベースとなる平らな表面をトリミングします。廃棄プラスチックスプーンと繊細なペイントブラシを使用して、ペトリ皿から断片を収集し、濾紙で余分な溶液を乾燥させます。

次に、スーパー接着剤を使用して、ビブラートメの標本皿に組織をしっかりと付着させ、アガロースブロックに接触するまで組織を取り付けます。ビブラートメの試料ディスクをビブラートメのバッファートレイに入れます。カミソリの刃をしっかりと固定して、ナイフホルダーを所定の位置にロックします。

スライス溶液を追加し、それが標本とブレードの両方をカバーしていることを確認します。その後、200マイクロメートルのスライスに標本をスライスし始めます。バッファートレイからスライス溶液を含むペトリ皿にスライスを移し、緩いエッジと余分な白質を約70%皮質と30%の白質の割合にトリミングします。

層流キャビネットでは、24ウェルプレートの各ウェルに600マイクロリットルの培養培地を加え、スライスをめっきする前に少なくとも20分間、5%の二酸化炭素を加えて摂氏36度でインキュベートします。この後、各ウェルに1つのスライスをプレートにペイントブラシを使用してください。プレートに未使用の井戸がある場合は、400マイクロリットルの無菌水で満たします。

5%の二酸化炭素で摂氏36度でインキュベートする。1ミリリットル当たり50ナノグラムの濃度で脳由来の神経栄養因子を有する、以前に調製された培養培地の10ミリリットルを補う。8~16時間後、各ウェルから333マイクロリットルのコンディション培地を取り出し、133マイクロリットルの新鮮なBDNF補充培地を添加します。

24時間ごとに、条件付き培地の3分の1を新鮮なBDNF補充培地に置き換えます。まず、培養培地を含むウェルからPBSを含む新しい24ウェルプレートにスライスを移す。各ウェルからPBSを取り出し、4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルに置き換えます。

摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、慎重にウェルからパラホルムアルデヒドを除去し、30%スクロース溶液の1ミリリットルに置き換えます。摂氏4度で48時間インキュベートします。

48時間後、凍結ミクロトームをマイナス40°Cに設定します。スライスを配置するミクロトームステージにスクロースベースを準備します。完全に凍結した後、冷凍スクロースの一部を切って、スライスが配置される平らな表面を作り出します。

次に、各スライスを引き延ばしたプラスチックフィルムの上に置き、ペイントブラシを使用して組織を平らにします。1回の移動で、伸ばしたスライスを冷凍スクロースベースに移します。スライスが5〜10分間凍結した後、スライスを30マイクロメートルのセクションに切ります。

30マイクロメートルの切片をPBSを含むペトリ皿に移し、実験計画に適した構造プロトコルに進みます。培養スライスの品質と健康を決定する際に、評価すべき重要な側面は、期待される神経細胞タイプ、ニューロンおよびグリア細胞の存在と典型的な形態である。ヒト皮質ラミネーションの典型的なアーキテクチャは、ニューロン免疫標識によって明らかにされた4日目のスライスで観察される。

また、ミクログリアやアストログリアの存在も予想される。これらの結果は、組織アーキテクチャが外科的処置、サンプル処理、またはインビトロでの短期間のいずれによっても有意に影響を受けないことを示す。塩化カリウム誘導脱分極に対する神経細胞応答は、ERKリン酸化に従うことによって培養スライスでも定量化されている。

興味深いことに、ERKリン酸化の明確な増加は、ビトロ4日に塩化カリウム処理スライスで見られます。最後に、毒性の課題に対するインビトロ4日目のスライスの反応は、過酸化水素を誘導する既知の酸化ストレス誘導体で評価される。スライスを過酸化水素300ミリモルに24時間曝露すると、MTT削減が堅調に減少した。

まとめると、過酸化水素チャレンジ後の5つのスライスで1日に観察された巨大な細胞死と塩化カリウム誘導脱分極結果は、酸化ストレスなどの有毒刺激に応答する4日目のスライスの保存された一般的な健康状態を示しています。このプロトコルは、主に、候補薬物による神経毒性および神経保護の分子メカニズムの調査など、1週間以上続くアッセイに基づく研究に専念している。このプロトコルは、マイクロ耐性側頭葉てんかんの外科的治療に提出された患者から採取された皮質組織を使用することに専念しているが、他の脳領域または条件から採取された組織も自由浮遊スライス培養を生成する源となり得る可能性が高い。

人間の脳からのスライス培養は、げっ歯類の脳から産生されるスライスに欠けている独自の細胞回路と分子機械のために、人間の神経病理学の理解を進める上で重要かもしれません。