ヒト幹細胞移植および検証のための ex vivo モデルとしての成体ヒト皮質の有機型培養

ヒト成人皮質の有機型培養は、これまでのところ、ヒト移植された細胞とヒト宿主細胞との間の相互作用を研究することを可能にする、損傷した皮質の幹細胞療法をテストするための唯一のシステムです。動物モデルでテストされた治療法は、げっ歯類とヒトの細胞の違いにより、臨床現場に変換すると通常失敗します。ここでは、移植された細胞、生存、分化、および機能をヒトからヒトへの環境で研究することができます。

この方法論は、神経回路が人間の脳でどのように機能するかを理解するのに役立ち、また、この知識の臨床現場への変換を刺激して、脳損傷後の機能回復を改善します。手順を実演するのは、博士課程の学生であるラクエル・マルティネス・キュリエルと修士課程の学生であるコスタンツァ・アレティオ・メディナで、どちらも私の研究室から来ています。まず、ベンチレーテッドフードの下の細胞培養ラボで、鉗子を使用して培養インサートを6ウェルプレートに入れます。

インサートの底部に5ミリリットルのヒト成人皮質培地を、膜に接触するまで加えます。気泡の形成を避け、インサートの上に2ミリリットルの培地を追加します。組織スライスをインサートに移す前に、インキュベーター内で摂氏37度と5%二酸化炭素で少なくとも2時間平衡化します。

手術室の患者から組織を凍結、気泡、粉砕した切断液の容器に集めます。氷上で密閉された容器をすぐにラボの切断領域に移します。組織を検査し、皮質層の向きを考慮して、ビブラトームの切断段階に接着するのに最適な表面を見つけます。

必要に応じて、メスで凹凸のある表面をカットし、最適なスライス方向になるようにティッシュをステージに配置します。次に、ティッシュ接着剤でティッシュをステージに接着します。それをスライスチャンバーに入れ、すぐに冷たい泡立った切断液で満たします。

切断手順全体を通してバブリングを続けます。次に、原稿に記載されているように、組織とブレードの向きに応じて冠状または矢状スライスをカットします。スライスを室温でバブリング切断溶液を入れた収集チャンバーに入れます。

すべての組織が切断されたら、スライスを室温のすすぎ溶液を含む滅菌ペトリ皿に移し、スライスから余分なスクロースを除去して細胞培養ラボに輸送します。次に、ティッシュスライスをウェットインサートと水中インサートの上に個別に置きます。24時間後、培地を交換して、切断手順から残っているスクロースまたはその他の残留物質を取り除きます。

2週間後、ゲンタマイシンを含まないヒト成人皮質培地を使用する。細胞培養フラスコから培地を取り出します。分化の7日目に、500マイクロリットルのトリプシンを加えて皮質プライミングGFP-lt-NES細胞を剥離し、室温で5〜10分間インキュベートします。

次に、等量のトリプシン阻害剤を添加し、続いて5ミリリットルのDDM培地を添加する。細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに静かに移し、300Gで5分間遠心分離し、ヒト組織を含むプレートをインキュベーターからフードに移し、インサートの上部から2ミリリットルの培地を取り出します。遠心分離の最後に、上清を除去し、細胞を冷たく純粋な基底膜マトリックスに再懸濁し、ペンションをより小さなチューブに移します。

細胞懸濁液を吸引用のゴム乳首に接続された冷たいガラス毛細管に集める。半乾燥組織スライスをさまざまな部位に刺して、細胞懸濁液を小さな滴として注入します。ゲルを摂氏37度で30分間固化させます。

次に、プレートをインキュベーターからフードに戻し、インサートの上部に2ミリリットルのヒト成人皮質培地を慎重に加えて、組織を完全に沈めます。急性ヒト成人皮質組織は、ニューロン、希突起膠細胞、およびアストロサイトの存在を示し、組織の最適な保存を示しました。この組織は、細胞培養の2週間後にニューロンマーカーNeuNおよびMap2の発現を示した。

全細胞パッチクランプ記録は、ニューロンが急性製剤からのニューロンに匹敵する静止膜電位および膜入力抵抗を持続させることを示した。細胞は新鮮な組織よりもわずかに活性が低かったが、ほとんどの細胞は複数の活動電位ではないにしても少なくとも1つの活動電位を発火させることができた。急性皮質組織ではミクログリアマーカーIba1およびTmem119の発現を示した。

培養2週間後、ミクログリアは急性組織よりも分岐が少なくなり、より活性化された形態を獲得しました。ex vivo移植の4週間後、移植されたGFP-lt-NES細胞は、器官型培養全体を通して広範かつ複雑な樹状化を伴う拡張神経突起を示しました。移植された細胞はほとんど保存状態が悪い組織で生き残った。

死細胞上の抗体の破片および非特異的標識は、ヒトスライス全体で広く観察された。移植が成功した場合、細胞は機能的に活性になり、成熟したニューロンは反復的でしばしば自発的な活動電位を示しました。速い内向きのナトリウム、遅い外向きのカリウム電流、および一定レベルのシナプス活性は、移植後4週間で移植片と宿主組織の機能的統合を示しています。

手術室から出た後の人間の組織の処理が速いほど、システムの実行可能性が高くなり、実験手順が成功します。