この方法は、転移の分子メカニズムに関する腫瘍生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遠隔器官内の腫瘍細胞の募集を定量化できることである。まず、非酵素細胞解離試薬を使用して、蛍光タンパク質発現ルイス肺癌(LLC)を、標準的なプロトコルに従って培養容器から細胞を除去することから始めます。
得られた細胞溶液を遠心分離前に15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離機は1回の洗浄につき5ミリリットルのPBSでペレットを2回洗浄する。2回目の洗浄後、40マイクロメートルの孔細胞ストレーナーを通して細胞を濾過し、1ミリリットル濃度の6細胞に10倍に希釈します。その後、29ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器に細胞をロードし、8〜10週齢のC57-Black-6、オスマウスの尾静脈に100マイクロリットルの細胞を注入します。
適切な実験エンドポイントで、はさみを使用して各マウスの腹側表面から皮膚を取り除き、肋骨と横隔膜を切断して胸腔を露出させます。右心室を通してPBSの15ミリリットルを洗い流し、心臓と胸腺を取り除くために25ゲージの翼を持つ注入針とチューブを使用してください。気管を鉗子でつかみ、引き上げ、気管の周りの結合組織を解剖して肺を収穫する。
次にPBSで肺を洗浄し、蛍光顕微鏡で蛍光細胞を可視化するために1つのローブを取り外します。肺組織を消化するには、まず尾頭葉をはさみでサイコロにし、肺片を10ミリリットルの注射器に入れる。プランジャーでシリンジを閉じ、5ミリリットルの消化液をシリンジに吸い込み、肺組織が溶液全体に広まるまでプランジャーを注射器シャフトの中と外に移動させる。
肺スラリーを50ミリリットルのチューブに分配し、逆シェーカーで37°Cと150rpmで15分間組織を消化します。インキュベーションの終わりに、肺細胞が完全に分散するまで残りの組織を三分化し、さらに30分間シェーカーにチューブを戻す。その後、40マイクロメートルの細孔ストレーナーを通して細胞を濾過し、遠心分離によって細胞を収集する。
単離した肺細胞をフローサイトメトリーで解析するには、ペレットを室温で1分間赤血球リシスバッファーの2ミリリットルで再懸濁し、遠心分離により細胞を採取する。次いで、ペレットを5ミリリットルの新鮮なPBSで2回遠心分離し、1回の洗浄につき1%ウシ血清アルブミンを補う。第2遠心分離後、新鮮なPBSとBSAの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによる腫瘍細胞の定量化のために新しい40マイクロメートルの孔ストレーナーを介して細胞を濾過する。
肺は注射の2時間後に多くのGFP-LLC細胞を提示し、細胞の大半は24時間以内に肺から消失する。なお、赤色フィルター内で検出された蛍光スポットは、細胞数から除外する必要があります。肺中のGFP-LLCの数を確認するために、示されているようにフローサイトメトリック分析にローブの1つを使用することができる。
この手順を試みる間、凍結断面手順は、腫瘍細胞の正確な位置を観察するためのより正確な方法であることを覚えておくことが重要です。
