エンドカンナビノイドは、様々な生物の複数の生物学的プロセスを調節する保存された脂質メディエーターである。最初に発見されたエンドカンナビノイドは、アナンアミドおよび2-アラキドノイルグリセロール、2-AGである。線虫C.elegansは、多種多様な生物学的プロセスを研究するための強力な動物モデルです。
最近、C.elegansにおけるコレステロールの密売の調節において、2-AGが基本的な役割を果たしていることを発見しました。これが、C.elegansでの検出と定量化によって内因性2-AGを研究する方法を設計し、最適化することが不可欠となった理由です。生物学的サンプルにおける2-AGを定量化する以前に報告された分析方法は、通常、商業的に取得された重水素規格の使用を含み、それらを購入可能にする必要がある。
それにもかかわらず、それらは高価であり、複数の二重結合の存在のために、時間の経過とともに酸化されるに敏感である。標準の最も一般的なバージョンは、液体クロマトグラフィー、および後質量分析法による同位体希釈法による定量に適したオクタード化アラキドン酸に基づいています。2-AGを定量化するための重水素規格のコストと安定性に関連する困難を克服するために、我々は重水素-5-グリセロールに基づく分析標準を調製するために便利で簡単な方法を用いた。
ペンデュート規格を準備するためのシーケンスには、3つの手順が必要です。必要になるまで保護された形で保管することが可能であること。この研究の主な目的は、C.elegansにおける2-AGを分析的な重水素規格の合成から線虫サンプルの調製と抽出、そして最後に液体クロマトグラフィーと質量分析による分析まで、完全な方法を示す。
定量アッセイのための重水素化された内部標準として重水素化1-AGを得るためには、3段階のプロトコルに従う。一次アルコールのみを保護するために、まずパスツールピペットを使用して10ミリリットル反応管に重水素化グリセロール38ミリグラムを加え、磁気スターラーを加えます。次に、5ミリリットルのハミルトンシリンジを使用して無水DCMを5ミリリットル加え、チューブに乾燥窒素を充填して不活性雰囲気を与えます。
蒸留した酢酸エチルを充填した浅いデュワーフラスコを使用してお風呂を準備します。密閉反応チューブを槽内に充填し、溶媒が凍結するまで酢酸エチルに液体窒素をゆっくりと加えて冷却します。注意,液体は室温で激しく沸騰し,眼や皮膚に接触すると重度のやけどを引き起こす可能性があります。
次に、ハミルトン注射器を使用して無水コリジンの54ミリグラムを追加します。注意,コリジンは揮発性であり、非常に強く不快な臭いを有する。70ミリグラムのテルブタイルジメチルセチルクロリドで、磁気スターラーでマイナス78度で3時間攪拌します。
反応を消すために2ミリリットルのブラインを加えます。2ミリリットルの蒸留ジクロロメタンを2ミリリットルずつ抽出し、毎回有機抽出物を保持する分離された漏斗を使用します。次に、3つの有機抽出物を組み合わせ、亜硫酸ナトリウムを乾燥させます。
シリカゲルを定常相として用いたカラムクロマトグラフィーと、100%ヘキサンから始まる10%上昇した酢酸エチル勾配で粗混合物を精製し、100%酢酸エチルで仕上げる。このエステル化ステップでは、パスツールピペットを使用して10ミリリットル反応チューブに記載された製品の10ミリグラムを追加し、磁気攪拌機を追加します。5ミリリットルのハミルトンシリンジを使用して2ミリリットルの無水DCMを加え、チューブに乾燥窒素を充填して不活性雰囲気を与えます。
氷浴を使用して溶液をゼロ度に冷却します。Ad 36 マルチボリューム調整可能なマイクロピペットを使用してアラキドン酸のミリグラムとかき混ぜる.その後、 15 40-メチルアミノピリジンのミリグラムを追加し、かき混ぜる.
マルチボリューム調整可能なマイクロピペットを使用してジアシルプロピルカルボジミドの15ミリグラムを追加し、かき混ぜます.2ミリリットルの水を加え、反応を焼き付け、分離漏斗を使用して2ミリリットルの蒸留DCMで溶液を3回抽出します。3つの有機抽出物を亜硫酸ナトリウムで乾燥し、シリカゲルを静止相として使用して粗混合物を精製し、その後100%ヘキサンから始まり、50 50%ヘキサン酢酸エチルで仕上げます。
最後に、脱保護工程のために、パスツールピペットを使用して10ミリリットル反応管に、以前に合成された生成物の15ミリグラムを加え、磁気攪拌機を加えます。5ミリリットルのハミルトン注射器を使用して無水テトラヒドロフランを2ミリリットル加え、チューブに乾燥窒素を充填して不活性雰囲気を与えます。その後、氷浴を使用してゼロ度に溶液を冷却します。
ハミルトンシリンジを使用してTHFでフッ化テトラブチラムモニウムの1モル溶液の150マイクロリットルのドロップワイズを追加します。1時間後、反応を消すために2ミリリットルの水を加えます。分離漏斗を使用して2ミリリットルの蒸留DCMで溶液を3回抽出する。
3つの有機抽出物を組み合わせ、亜硫酸ナトリウムの上に乾燥させます。漂白手順では、種付き6センチメートルNGMプレートにワームを回します。皿の上に卵とグラビッド大人がたくさんあるように、ワームが2〜3日成長することを許可します。
卵と大人がたくさん入ったら、5ミリリットルのM9をプレートに注ぎます。ガラスピペットを使用して、ワームを15ミリリットルのハヤブサチューブに移します。2,000Gでチューブを2分間遠心分離し、ワームをペレットします。
M9の大部分を、ワームペレットを邪魔することなく吸引します。漂白液を3ミリリットル加え、約5分間反転するか、無傷の成虫の数が減少するまで、溶液を穏やかに混ぜます。ほとんどの体が溶解したら、遠心分離機は2,000 Gで1分間行います。
ワームペレットを乱すことなく、漂白液のほとんどを吸引します。チューブにM9の15ミリリットルを追加し、よく混ぜます。2,000Gで再び遠心分離機を1分間行う。
M9の大部分を、ワームペレットを邪魔することなく吸引します。ワームサンプル調製の場合、漂白手順によって得られたN2胚を20度のM9緩衝液中に一晩入れさせた。次いで、2,000 Gでチューブを2分間遠心してL1sを収穫し、M9バッファでワームをもう一度洗浄し、生きたL1の数を定量化する。播種約10,000虫を、以前に乾燥したOP 50大腸菌の1ミリリットルでNGMプレートに入る。
ワームがL4段階に達するまで、少なくとも20度でプレートを48時間インキュベートします。50ミリリットルのハヤブサチューブに冷たいM9バッファーを使用してワームを収穫します。もう一度洗って、1.5ミリリットルのチューブに移します。
2,000Gで1分間遠心分離により虫をペレット化する。上清のほとんどを排除します。その後、チューブを液体窒素に浸し、マイナス80度で攪拌します。
N2に属する約100マイクロリットルの凍結ワームペレットを解凍し、1.3ミリリットルのメタノールを加えます。その後、サンプルを4分間超音波処理します。超音波処理の後、1,000ppbの内部重水素標準、2.6ミリリットルのクロロホルム、0.5モルの塩化カリウム、0.08モルの蛍光体を1対1の最終比に加えます。
1分間サンプルを渦出し、氷の上で15分間超音波水浴でそれらを超音波処理します。再び2回2回試料を1分間渦化し、2,000Gで10分間遠心分離して相分離を誘導する。低相をきれいなガラス管に集め、窒素の下で乾燥させ、100マイクロリットルのアセトニトリルで再懸濁します。
内因性2−AGの定量化を成功させるためには、3段階法を用いて飽和アナログを合成する必要があった。その後、ワームサンプルに添加し、高速液体クロマトグラフィーによって抽出および分析し、質量分析に結合した。内部標準として使用され、合成重水素化1-AGは内因性代謝産物を定量化するツールであった。
この方法は、2-AGの遷移とグリセロール分子が失われる重水素化1-AGの遷移を用いて最適化された。C.elegansサンプルからの2-AG内因性は、質量分析に結合した高速液体クロマトグラフィーを用いて化学的に合成されたデュータナイズされた1-AGで同位体希釈によって検出され、定量化された。サンプル1は、重水素化標準1-AGで調製し、一方、サンプル2は標準を除く。
試料1及び3個の除行標準の元の濃度は1,000ppbずつであったため、ピーク面積比から試料3の場合は340ppbの試料中の2-AGの内因性濃度を計算し、サンプル3に360ppbの平均を与える。この比率は、2−AGのピーク領域と重水素化1-AGの間の品質として、それぞれ2つの単離されたサンプルについて計算した。重水素化された標準との両方が抽出に前に追加した。
コレステロールの密売の強化における2-AGの最近発見された重要性と、脂質がそのプロセスに及ぼす影響の情報の欠如を考えると、このエンドカンナビノイドには信頼できる検出方法が必要であった。このプロトコルの重要なステップは、ここで報告された単純で堅牢な合成方法の開発に成功し、重水素化アナログ2-AGを得ることが重要なステップでした。報告されたモノアシルグリセロールを定量化するほとんどの方法は、通常の貯蔵条件下で高価で不安定である市販の分析基準の使用を含み、低予算の実験室では到達不能になります。
しかし、この方法は、よりアクセスしやすい出発材料を用いて標準の合成を提案することによってこれを解決する。合成方法は、高度な条件が必要なくまっすぐに進み、低予算であっても、最小限の装置と反応物へのアクセスで任意の実験室で行われることが理想的です。要約すると、この新しい手順は、C.elegansのコレステロール密売におけるこれらのエンドカンナビノイドの役割の説明の後に提起されたいくつかの質問に答えるのに役立つ2-AGを検出し、定量化する簡単で再現可能な方法を説明する。
