ここでは、ワームアライメントという名前の単純なオープンソースフィジーベースのワークフローを説明し、これを使用して、生の顕微鏡画像から関心のある矯正ワームの単一または複数チャネルのモンタージュを生成することができます。このワークフローはユーザーが選択した対象の動物に依存するため、ワームがすべて正しい段階または条件でない C.elegans の画像を分析する場合に特に便利です。ワームアライメントの出力は、フィジーまたは他の画像解析ソフトウェアを用いた蛍光のその後の定量に使用できることに留意すべきである。
ここでは、CellProfiler パイプラインWorm_CPを使用した蛍光定量を示します。 ブンゼンバーナーの炎の中に薄いガラス毛管を伸ばして口マイクロピペットを作成します。炎の延長後、延長後に毛細血管を2つに分割しなかった場合は、2つに分割します。
2つに分けた場合は、最も長い端を切ります。長い部分を選択し、水を吸引しようとすることによって毛細血管が開いているかどうかをテストします。アダプターを 3 ミリメートルシリコンチューブから取り外します。
ガラスキャピラリーを6ミリメートルのシリコンチューブに接続されたキャピラリーアダプターに差し込みます。その後、6ミリメートル管のもう一方の端を0.2マイクロメートルのフィルターに差し込み、もう一方の端に3ミリメートルのシリコーンチューブを差し込みます。3ミリメートルシリコンチューブの自由端に1ミリメートルのフィルターチップを差し込み、液体を吸引します。
解剖顕微鏡の下で、口マイクロピペットで固定ワームのペレットの周りにできるだけ多くの液体を取り除きます。10マイクロリットルの取り付け媒体をチューブの底部に素早く加えます。PBSで10マイクロリットルのチップを洗浄剤の痕跡で洗い、ワームがプラスチックピペットチップの側面に付着するのを防ぎます。
その後、先端の端をハサミで切ります。前に準備されたアガロースパッドにワームと取り付け媒体の8マイクロリットルを移します。顕微鏡下でスライドを観察しながら、ワームの重なりを避けるために穏やかに攪拌します。
その後、アガロースパッド上の取り付け媒体の落下を18 x 18ミリメートルのカバースリップで覆います。生きたワームをマウントするには、3ミリモルレバミソールのピペット3〜4マイクロリットルをM9に溶解し、アガロースパッドに取り付けます。レバミソールのドロップに条件ごとに30〜50ワームを選びます。
その後、18 x 18ミリメートルのカバースリップでドロップをカバーし、1時間以内にワームを画像化します。オープンソースイメージ分析ソフトウェアパッケージFijiをImageJからインストールするか、既にコンピュータにインストールされている場合は、バージョン1.52A以降であることを確認してから、Worm-alignリポジトリをGitHubからダウンロードしてコンピュータに保存します。すべてのパイプラインコンポーネントがダウンロードされ、インストールされたら、フィジーを開き、プラグイン、マクロをクリックしてワームアライメントマクロを実行し、メインメニューバーで実行します。
ワーム位置合わせを見つけます。ijm スクリプトをクリックし、[開く] をクリックします。解析対象の画像が含まれる入力フォルダに移動し、[select]をクリックして、選択したフォルダに画像ファイルのみが含まれていることを確認します。
マクロは、すべての結果が保存される出力フォルダーを自動的に生成します。フォルダーの名前は、ポストフィックスとして出力を持つ入力フォルダーと同じになります。入力フォルダー内の最初の画像を開き、それを代表画像として使用して、ワームの幅、明るさ、コントラストなど、モンタージュの生成に必要な設定を抽出します。
直線描画ツールを使用して、ワームの幅を横切って線を引き、[OK]をクリックします。この行の長さを使用して、単一ワームのトリミング領域の高さを決定します。各チャネルに対して、名前、参照テーブル、およびモンタージュに含めるかどうかを指定し、[OK] をクリックします。次に、スライダーを使用してチャンネルの明るさとコントラストの設定を調整します。残りのチャネルに対してこのプロセスを繰り返します。
すべての設定を構成すると、設定テーブルに記録され、出力フォルダーの CellProfiler サブフォルダーに保存されます。設定の適用後にすべての画像がどのようなものになるかを示すために、画像が生成されます。画像が満足のいく場合は、トップボックスにチェックを入れます。
チェックの 2 番目と 3 番目のボックスすべての設定パネルは、モンタージュの生成のオプションを指定します。両方のボックスにチェックを入れたまま、[OK] をクリックしてマクロの残りの部分を実行します。トップ ボックスにチェックを付けられなかった場合、マクロはセットアップを再実行します。
次に、マクロは入力フォルダ内のすべての画像を開きます。各画像について、セグメント化された線ツールまたはフリーハンドラインツールを使用して、モンタージュに含まれるすべてのワームの縦軸に線を描画します。ワームの全長に沿って頭から尾まで、またはその逆に一貫して線を引き、必要なすべてのワームが追加されたら、[OK]をクリックして[コントロール]をクリックしてROIマネージャに各線を追加します。その後、ワームアライメントによって、選択した 1 つのワームのトリミングされたイメージが生成され、出力フォルダの単一のワーム サブフォルダに保存されます。
選択したすべてのワームのモンタージュは、整列されたフォルダに保存されます。ダウンロード ページで以前の CellProfiler リリースのリンクをクリックし、必要なオペレーティング システムを選択して、CellProfiler 2.2.0 をダウンロードしてインストールします。Worm_CPパイプラインを開始する前に、期待されるすべての出力イメージが Worm-align 出力フォルダーの CellProfiler サブフォルダーに存在することを確認します。
元の画像の処理済みコピー、ワーム集団のバイナリ画像マスク、選択したワームに線が引かれている場合はマスクを整列し、元の画像の各チャンネルを表す画像を1つ揃える必要があります。CellProfilerを開き、画像入力モジュールをクリックし、ここにファイルとフォルダをドロップすると言うウィンドウにCellProfilerモジュールフォルダをドラッグします。以前の分析から画像のリストが表示されている場合は、まずウィンドウ内で右クリックして [ファイルリストのクリア] を選択して、これらを削除します。
メタデータ入力モジュールをクリックし、2 番目の抽出方法で黄色のフォルダーをクリックし、ワーム位置合わせ出力フォルダーの CellProfiler サブフォルダーに移動します。設定ファイルを選択し、[更新]をクリックします。次に、名前と型の入力モジュールをクリックし、パイプラインに必要なすべてのイメージが存在することを確認します。
パイプラインを実行する前に、出力モジュールで出力結果の出力先を選択します。テスト モードを使用して、[テスト開始] モードをクリックしてパイプラインのパフォーマンスを確認し、フォルダー内の最初のイメージを実行できるようにします。パイプラインのパフォーマンスに満足したら、[テスト モードの終了] をクリックしてイメージを分析します。
分析を開始する前に、解析モジュールの前のすべての目が閉じられていることを確認します。分析が完了したら、2 つの CSV ファイル、ワーム CSV と行 CSV で構成される Worm_CP出力フォルダーを開きます。このプロトコルに記載された方法に従ってC.elegansを培養およびイメージングすると、ワーム集団の大規模な概観画像が生成される。
パイプラインの出力は、画像の上に描画される線の品質に大きく依存します。ここでは、いくつかの行の例と、ワームアラインからの出力を示します。ワームアライメントスクリプトを使用する場合、データサブフォルダにあるオーバーレイ画像やモンタージュ内の個々のワームのパネルから、交差するワームの視覚的な識別が可能です。
QCテーブルは、重複するワームを識別するためにも使用できます。ただし、交差する線はWorm_CPパイプラインでは問題になります。これは、Worm_CPが個々のワームを識別するために、対象地域ではなくライン マスクを使用するためです。
したがって、CellProfiler はワームの 1 つを 2 つのオブジェクトとしてセグメント化します。Worm_CPパイプラインは、脂質滴に組み込まれた蛍光色素で標識された固定動物からの蛍光強度を定量化するために使用されています。脂質滴の含有量は手動定量を使用して野生型と変異型DBL1動物の間で17%減少し、Worm_CPパイプラインを使用して12%減少する。
Worm_CPは、熱ショック誘導性遺伝子の制御下でGFPを発現する生きたワームの熱ショック応答を定量化するためにも使用された。熱ストレスがない場合、ワームはGFP発現を誘発しなかった。ワームが短い熱ショックとして暴露されると、GFP発現が誘発される。
Worm_CPの出力は、ワームアライメントを使用して描画する線の品質に大きく依存します。線が接触または重ならないようにして、すべての線を同じ方向に描画します。QC テーブルをチェックすると、接触またはオーバーラップしているラインを識別し、解析からそれらのケースを除外することができます。
ワームアラインの出力は、フィジーまたはその他の画像解析ソフトウェアパッケージで、後続の定量に使用できます。ここでは、脂質滴の数をカウントしたり、ワーム内の個々の液滴の強度を定量化したりするなど、他の分析モジュールを非常に簡単に組み込むことができる非常に基本的なCellProfilerパイプラインを示しました。この技術の利点の1つは、個々のワームからの蛍光を迅速に定量する可能性である。
私たちの研究室では、蛍光レポーターを使用して個々の生存率に関心を持っており、この目的のためにワームアライメントとWorm_CPを日常的に使用しています。
