Name: in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans at JoVE.com

I thank Dr. Maureen Barr, under whose supervision the dauer IL2 remodeling phenotype was initially characterized. Thanks to Dr. C. Britt Carlson for critical reading of the manuscript. Funding in the Barr lab was from the NIH (5R01DK59418) and postdoctoral fellowships from the USDA (2010-65106-20587) and the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Current funding for this work is from a University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE grant.

1原油Dauerフェロモン生産<ol><li> OP50 E.を育てる200rpmでLBブロス100mLに振とうしながら37℃でシングルコロニーO / Nから大腸菌 。注：このO / N培養物を、事前に作製し、4℃で保存することができる。 </li><li> N2 C.を育てる虫について15から20 OP50 E.を50μlを接種したNGM寒天（表1のレシピを参照してください）と6センチメートルペトリ皿大腸菌は菌までほとんど19を空乏化される。 </li><li> 1リットルのエルレンマイヤー中のS·メディアの5倍250ミリリットルを（表1のレシピを参照してください）makeは19フラスコ。注記：この溶液は、事前に行うことができる。 </li><li> OP50 Eの文化を育てるE.におけるOP50 1mlで接種することによりLBブロスOの4のL / Nが大腸菌大腸菌および16時間37℃で振とう。 </li><li> 4-（ステップ1.3で調製したSメディアとの4 1Lの三角フラスコのそれぞれに4-5プレートから1 S基底溶液（表1のレシピを参照）、転送線虫でプレート（ステップ1.2）から線虫を洗う5プレート各フラスコのための）19。 </li><li> 10分間650×gでステップ1.4からOP50を遠心し、上清を除去します。 S基底溶液10mlに各細菌ペレットを再懸濁。線虫の各フラスコに再懸濁した細菌の同量を転送します。 </li><li>解決策は、食品の枯渇を示す、クリアし始めるまで5日間 - （ - 25°Cの20）および100 - 4 150 rpmで室温でオービタルシェーカーフラスコを置きます。 </li><li>食料が枯渇したら、OP50 Eの別のO / N培養を育てるLBブロスの4倍1L中大腸菌 。 10分間650×gで、細菌を遠心分離し、線虫とSメディアフラスコのそれぞれに1フラスコからのペレットを追加します。食べ物が再びなくなるまでさらに3〜4日間、ステップ1.7のように、オービタルシェーカーにSメディアフラスコを返します。 </li><li>各フラスコからの溶液〜1ミリリットルのアリコートを取り、サブサンプリング、各1ミリリットルアリコートから1μLをし、線虫の数をカウントすることによって、線虫の濃度を推定。注：75,000線虫/ mlの - 線虫の人口50,000にする必要があります。この濃度での線虫の大部分はdauersある。 </li><li>いずれの汚染されたフラスコを捨てる。注：汚染が頻繁にステップ1.9の間に見られる真菌の菌糸として現れる。 </li><li> 4℃で10分間、4,000×gで遠心分離した線虫。線虫のペレットを捨て、上清を保持している。別の方法として、低効力フェロモンを作るためにこれらの動物を使用するための説明を参照してください。 </li><li> ＃1ワットマン濾紙で上澄みをろ過する。 NOTE：真空フラスコは、このプロセスを促進するであろう。 </li><li>さらに0.45μmの無菌真空濾過ユニットを通して上清をフィルタリングする。注：ろ液を4℃でO / N保たまたは1.14に進むことができます。 </li><li>攪拌棒を備えた2リットルのビーカーにろ液を追加します。加熱撹拌プレート上のドラフト内に置きます。攪拌しながら沸騰させ、約200mlに蒸発する。 500ミリリットルのビーカーにソリューションを転送します。約50ミリリットルがルになるまで沸騰続行フィート注：ソリューションがオーバー沸騰することは可能であるように注意がこのステップの間に注意する必要があります。最後の50ミリリットルの色はダークブラウンです。調理プロセス中の任意の時点で、加熱を停止することができ、ろ液をRTまたは4℃でO / Nを記憶する。 </li><li>クール1,000×gで5分間遠心分離してみましょう。 100ミリリットルのビーカーに上清を注ぎ、ペレットを捨てる。 </li><li>茶色の皮に、上清を煮詰める。暑さから削除し、へらで地殻を破る。地殻をカバーするのに十分な200プルーフのエタノールを追加します。パラフィルムでビーカーをカバーし、それは、室温でO / Nを座らせて。きれいなビーカーにエタノールを捨て、横に置く。地殻をカバーする新たなエタノールを追加します。 O / Nの抽出を3回繰り返します。抽出物をプール。 </li><li>エタノール抽出を乾燥させるために、真空ポンプを使用してください。真空ポンプが使用できない場合はドラフト内で攪拌しながら、50℃にきれいなビーカーと暖かいにエタノール抽出物を追加します。注：エタノールをlの粘着性の残留物を蒸発した後IGHTブラウン色がままにしてください。加熱が使用される場合、注意が長すぎるために加熱して溶液を燃焼しないように注意すべきである。 </li><li>滅菌蒸留水10mlに残渣を溶解。フィルターは1mlアリコートにおいて-20℃で0.22μmのシリンジフィルターとストアこの溶液を滅菌する。 NOTE：1mlの水は、元の液体線虫培養物100ml毎ための残渣を溶解するために使用される。液体培養フラスコの一つは、汚染に起因して破棄された場合、次に残留物を溶解するために使用される水の量を調整する。 </li></ol>フェロモン用量反応の2の決定<ol><li>ペプトンことなく、ノーブル寒天でNGM培地の6倍5ミリリットルを行うことで、dauerフェロモンを準備し、および50μg/ ml硫酸ストレプトマイシンとdauerフェロモンの範囲（表1のレシピを参照してください）4、19を補充した。13x100 mm単位で成分を混合ガラス培養管は、ブンゼンバーナーの上に沸騰してから、3センチメートルペトリ皿に注ぐ。 </li><li>午前の重量を測定icrocentrifugeチューブ。 EのO / N培養の1ミリリットルを追加します。マイクロチューブ内〜17000×gでチューブと遠心分離機に大腸菌 OP50。上清のすべてを削除します。再びチューブを計量し、細菌ペレットの重量を決定する。 4％の最終濃度（表1の処方を参照）M9緩衝液でペレットを再懸濁（w / v）の 。一定分量の各フェロモン板4の中央部への細菌懸濁液10μl。 RTで保管プレートO / N。 </li><li> 10-15妊娠N2野生型の雌雄同体のフェロモン板4の上に大人になって脱皮した後、ある日を選択してください。 4時間 - 3、25℃でプレートを保管してください。 </li><li>大人の雌雄同体のすべてをオフに選んでください。各プレートについての産卵数を記録します。パラフィルムでプレートを密封し、3日間17 25℃に戻ります。 </li><li> dauersのパーセンテージをカウントし（ 図2）。注：両方の方法のためには、dauers（およびより少ない元に留意することが重要である10トン非dauers）が壁を登るとペトリ皿の蓋の上になります。これは、線虫のための料理のすべての表面を調べることが重要である。 </li><li>用量反応曲線にデータをフィットし、 図3に示すように、（dauersを形成するために、動物の90％を誘導するのに十分なフェロモン）フェロモンのEC 90濃度を推定注：私たちは、典型的にはEC 90を推定するためにロジスティック回帰モデルを使用ししかし、異なる統計ソフトウェアパッケージは、同様の推定値を生成する別の方法を有することができる。 </li></ol> Dauer IL2ニューロンの3。ライブイメージング<ol><li>ステップ2.6で決定されたEC 90値を使用して、プロトコル2のようにdauerフェロモンプレートを準備します。 </li><li>統合されたIL2レポーター導入遺伝子を有する株（myIs13 [PのKLP-6 :: GFP]、myIs14 [PのKLP-6 :: GFP]、myIs16 [Pで、プロトコル2の方法を使用してdauersを誘導する<eM&gt; KLP-6 :: tdTomato]またはqIs56 [P ラグ-2 :: GFP]）12、20、21注：Q Is56を使用する場合には、GFPの発現は、中に数時間までIL2Qsに表示されませんdauer脱皮し、初期のリモデリング事象の一部が表示されません。 P ラグ-2 :: GFP導入遺伝子からの蛍光シグナルは、P KLP-6蛍光レポーターよりdauer中にIL2sにおける究極的に明るくなっている間に加えて、P ラグ-2は :: GFP導入遺伝子はまた、頭部の筋肉に弱く発現する細かいIL2の枝をマスクすることができます。 </li><li>産卵の後、大人の雌雄同体を削除するパラフィルムでプレートを密封し、25℃17で34時間インキュベートする。注：dauerの脱皮までの時間の長さは、個体間でわずかに異なります。 dauer脱皮の開始後5時間（39 - - デンドライト樹枝状分岐の中で最も急速な期間は4を開始する44時間後に産卵25℃で）12。 </li><li>イメージング前日は、EC 90濃度のdauerフェロモンとM9緩衝液中の10％（w / v）アガロースの溶液を作る。アリコートをアガロースの約100μlの顕微鏡スライド上に、迅速に、かつ慎重に、平らなアガロース面を作成するために上に別のスライドを置く。アガロースが固化した後、湿度室（ウェットペーパータオルでピペットチップボックス）にサランラップや店舗でスライドを包む。 </li><li> 34時間のインキュベーション期間の後、咽頭のポンピングを停止した線虫のためのフェロモンプレートを調べます。つのスライドの片面のみがそれをアガロース有するように、別個のスライド。 10％のアガロースパッドと0.1ミクロンのポリスチレンビーズ22の1μlの上に1つ以上の線虫を選択してください。注：よく同期人口、プレート上の線虫の大部分はL2dをからdauerに脱皮を締結されます。しかし、私の中で変​​動​​があるかもしれないndividuals。それは、動物はdauer脱皮内であった時間（例えば代表的な結果を参照してください）​​の量を推定するための追加機能（ストーマ閉塞、咽頭リモデリング）を注意することが重要である。 </li><li>線虫の向き（左/右、背側/腹側）を決定します。可能な限り低い蛍光強度100倍、15分毎にIL2QデンドライトのZスタック画像を取り込むか、特定の実験の必要に応じ。線虫はL2dのキューティクルおよび固定化から分離するまで、画像を撮影続行動物はdauerから回復した場合（咽頭のポンピングを開始する）ことは不可能であるか。積極的にイメージングしない場合には、湿度チャンバ内のスライドを置く。注：私たちは、電動ステージと微分干渉コントラスト（DIC）光学系と落射蛍光顕微鏡を使用しています。 </li></ol>

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	<li>West-Eberhard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental Plasticity and Evolution. , (2003).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).</li><li>Riddle, D. L., Albert, P. S., Riddle , D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , 739-768 (1998).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva:+developmental+effects+of+pheromone,+food,+and+temperature.">The Caenorhabditis elegans dauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature.</a> Dev. Biol. 102, 368-378 (1984).</li><li>Riddle, D. L., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode C. elegans. , 393-412 (1988).</li><li>Fielenbach, N., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+dauer+formation+and+the+molecular+basis+of+plasticity.">C. elegans dauer formation and the molecular basis of plasticity.</a> Genes Dev. 22, 2149-2165 (2008).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218, 578-580 (1982).</li><li>Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+pheromones+that+control+dauer+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Chemical Biology. 3, 420-422 (2007).</li><li>Jeong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433, 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454, 1115-1118 (2008).</li><li>Schroeder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer-Specific+dendrite+arborization+in+C.+regulated+by+KPC-1/Furin.">Dauer-Specific dendrite arborization in C. regulated by KPC-1/Furin.</a> Curr. Biol. 16, 1527-1535 (2013).</li><li>Procko, C., Lu, Y., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+delimit+shape+changes+of+sensory+neuron+receptive+endings+in+C.+elegans.">Glia delimit shape changes of sensory neuron receptive endings in C. elegans.</a> Development. 138, 1371-1381 (2011).</li><li>Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+alterations+in+sensory+neuroanatomy+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva.">Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva.</a> J. Comp. Neurol. 219, 461-481 (1983).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+chemosensory+control+of+dauer+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 130, 105-123 (1992).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+chemosensory+defects+in+daf-11+and+daf-21+mutants+of+Caenorhabditis+elegans.">Multiple chemosensory defects in daf-11 and daf-21 mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 303-316 (1994).</li><li>Ailion, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer+formation+induced+by+high+temperatures+in+Caenorhabditis+elegans.">Dauer formation induced by high temperatures in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 156, 1047-1067 (2000).</li><li>Neal, S. J., Kim, K., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pheromone Signaling. , 273-283 (2013).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Ouellet, J., Li, S., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+is+required+for+both+dauer+maintenance+and+recovery+in+C.+elegans.">Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans.</a> Development. 135, 2583-2592 (2008).</li><li>Blelloch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gon-1+gene+is+required+for+gonadal+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, (2012).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> J. Exp. Zool. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Singh, R., Sulston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans.">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

dauer特有の神経可塑性およびその他のdauer関連形態学的変化を調べたところ、遺伝子変異（ すなわち、DAF-C変異体）を介して、またはフェロモンに野生型動物の曝露のいずれかによってdauersの制御された、信頼性の高い形成する必要がある。 dauersを誘導する遺伝子変異の使用が便利であるが、それは、結果を混乱させることがある。したがってDAF-cの変異を有する収集されたデ?...

発達や行動の可塑性を含む表現型の可塑性は、不利な環境条件に適応するために重要であると進化1の原動力であると考えられる。C.虫が頻繁に開発·神経生物学における研究のために使用されるモデル生物である。理想的な条件下で、C.エレガンスは、成人の生殖段階に入る前に4幼虫の段階を経て開発しています。しかし、低食品の可用性と高い人口密度、Cの条件の下でエレガンスは、発達スイッチを受け、長い寿命とストレス耐性のdauerステージ2に入ることができる。 Dauersはおそらく、このストレス耐性を媒介する非dauersからのいくつかの形態学的および行動の相違を示す。 dauerエントリを規制する環境的合図と遺伝的経路は広範囲に3、4、5、6、7について説明したが、分子機構をdを発生する個別の表現型の変化を制御するuringのdauer形成はあまりよく理解されている。 dauer固有の表現型の検査はdauer動物の生産を必要とします。これは、3つの方法で達成することができる。1）Cの飢えた培養物からピッキング虫 、dauer形成構成的（DAF-c）の変異体の2）を使用し、精製されたフェロモンを通じてdauer形成の3）誘導。これは、Cと標準のNGMプレートからdauersを選ぶことは比較的簡単であるその細菌の食料供給を使い果たした虫個体群。私達の手の中に、標準的なNGMプレートがもともと3日間成長させ、その後3を接種したOP50 大腸菌 50μlを、を播種4 -成体雌雄同体は、一週間以内に食糧供給を排気して数千を生成し、25℃に保っさらに3日以内にdauers（多数の飢餓状態の非dauersに加えて）。しかし、この方法は、dの中に脱皮中に発生するプロセスを調べるため不十分であるアウアー。これは、典型的な飢餓プレート上の動物はdauerに入力している数千のかを判断することは困難である。さらに、飢餓状態のプレートの使用は、同期のための可能性を提供していません。 DAF-cの変異体の使用は、同期とdauersの信頼性の高い生成を可能にする。しかし、特定のDAF-C変異は、単独で、またはさらなる変異と組み合わせて他のdauer固有の表現型に影響を与えないという保証はありません。 dauerフェロモンの存在が最初Cassadaとラッセルによって暗黙以降ゴールデンとリドルによって実証された。フェロモンは、以来、化学的に2、図8、図9、図10に特徴付けられている。精製されたフェロモンは異なる形で両方の行動や発達過程9を規制ascarosidesの複雑なブレンド、11で構成されています。使用した粗dauerフェロモン抽出物dauerを可能にする野生型のバックグラウンドで同期されたdauersの信頼性が制御さ誘導。 </P&gt; 神経系および関連するグリア細胞がdauer幼虫形成が12、13、14時のリモデリングを受けています。これらの変更のいくつかは、そのようなdauer 13、14時のグリア細胞のリモデリングとして、不可逆的であるが、他のリモデリング事象が良好に戻った際に可逆的である環境条件。デンドライト樹枝状分岐、multidendriticニューロンと軸索リモデリング〜12の単一樹状からスイッチ：たとえば、4 IL2Qニューロンの集合が含むdauer形成時の迅速かつ可逆的神経細胞リモデリングを受ける。本明細書の方法は、モデル生物におけるストレス誘発神経可塑性の信頼性のin vivoイメージングを可能にします。生産、粗dauerフェロモンの試験のために提示される方法は、以前にいくつかの情報源4、8、15、16、17、18から説明され、コンパイルされている。

<table><tbody><tr><td>N2 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; Bristol strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] III</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2762 myIs14[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JK2868 qIs56[P&lt;sub&gt;lag-2&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O autoclaved cooled to 55&amp;deg;C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>S Media</td><td>Various</td><td></td><td>S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.5 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate&lt;sub&gt;, &lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g MnCl2&amp;bull;4 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.29 g ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.025 g CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;5 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, and 0.75 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>Dauer pheromone plates for dose-response assay</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 &amp;micro;l of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to bring the volume to 4.725 ml.&amp;nbsp; Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 &amp;deg;C. Add 125 &amp;micro;l 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 50 &amp;micro;l 0.1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 50 &amp;micro;l 0.1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 50 &amp;micro;l of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.&amp;nbsp; Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).</td></tr><tr><td>Microsphere beads 0.1 micron</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans

動物でストレス誘発表現型の可塑性を制御するメカニズムは、生体内で勉強することがしばしば複雑で困難である。ストレス誘発性可塑性の典型的な例はCのdauer段階である虫 。 Dauers、細菌食品やdauerフェロモン高濃度、低濃度の条件下で形成された代替案の発達幼虫期である。 Dauersは、広範な発達や行動の可塑性を表示します。例えば、4つの内側陰唇象限（IL2Q）ニューロンのセットはdauer形成中に豊富な可逆的リモデリングを受ける。 dauerエントリを調節するよく知られた環境の経路を利用して、大量の液体線虫培養物からの粗dauerフェロモンの製造のための以前に確立された方法が示されている。この方法では、50,000濃度 - 液体培養の線虫75,000 / mlを非常に強力な粗dauerフェロモンを生成するのに十分である。原油フェロモン効力はDETEです用量反応バイオアッセイによりrmined。最後に、dauer形成中IL2Qs のin vivoタイムラプスイメージングのために使用される方法が記載されている。

暑さと寒さに安定でもある黄色の液体中の粗dauerフェロモン結果（ 図1）の産生。原油フェロモンのアリコートの活性の明らかな損失で無期限に-20℃で保存されている。フェロモンの生産に続き、単用量反応バイオアッセイは、効力を概算するのに十分である。 3回、各実験からの平均を取る - しかし、ほとんどの実験のためにはバイオアッセイ2を繰り返す必要がある。 2フェロ?...

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In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

in-vivo-imaging-of-dauer-specific-neuronal-remodeling-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

11.2K ビュー.  University of Illinois Urbana-Champaign. Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer. 

ビデオ: In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

のためのシンプルなマイクロ流体デバイス<em生体内で&gt;</emの&gt;イメージング<em&gt; Cエレガンス</em&gt;<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;とゼブラフィッシュ

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

生物工学

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

生化学

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

神経科学

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

生物学

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million people worldwide. Since many details about PD etiology remain unknown, studies investigating genetic and environmental contributors to PD are needed to discover methods of prevention, management, and treatment. Proper characterization of dopaminergic neuronal loss may be relevant not only to PD research, but to other increasingly prevalent neurodegenerative disorders.
There are established genetic and chemical models of dopaminergic neurodegeneration in the Caenorhabditis elegans model system, with easy visualization of neurobiology supported by the nematodes&#39; transparency and invariant neuronal architecture. In particular, hermaphroditic C. elegans&#39; dopaminergic neuron morphological changes can be visualized using strains with fluorescent reporters driven by cell-specific promotors such as the dat-1 dopamine transporter gene, which is expressed exclusively in their eight dopaminergic neurons.
With the capabilities of this model system and the appropriate technology, many laboratories have studied dopaminergic neurodegeneration. However, there is little consistency in the way the data is analyzed and much of the present literature uses binary scoring analyses that capture the presence of degeneration but not the full details of the progression of neuron loss. Here, we introduce a universal scoring system to assess morphological changes and degeneration in C. elegans&#39; cephalic neuron dendrites. This seven-point scale allows for analysis across a full range of dendrite morphology, ranging from healthy neurons to complete dendrite loss, and considering morphological details including kinks, branching, blebs, and breaks. With this scoring system, researchers can quantify subtle age-related changes as well as more dramatic chemical-induced changes. Finally, we provide a practice set of images with commentary that can be used to train, calibrate, and assess the scoring consistency of researchers new to this method. This should improve within- and between- laboratory consistency, increasing rigor and reproducibility.

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

In this article, we showcase how to use a seven-point scoring system to consistently quantify changes to dopaminergic neuron dendrite morphology in C. elegans. This system is intended for analyses of dopaminergic neurodegeneration assays utilizing genetic, chemical, and age-based models of neurodegenerative disorders.

カエノハブディティス・エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロン形態変化と変性の定量化

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

要約

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のためのシンプルなマイクロ流体デバイス

C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

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イメージング C.エレガンス胚

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

カエノハブディティス・エレガンスにおけるドーパミン作動性ニューロン形態変化と変性の定量化

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング