ここでは、骨再生能力の観点から骨置換材料を評価することを目的として、ウサギのための外科プロトコルを提示する。このウサギのカルバリアモデルの基本原理は、頭蓋骨の皮質部分の上に垂直に新しい骨組織を成長させる。このモデルは骨の成長サポートおよび新血管化のサポートの点で口腔および頭蓋顔面骨再生のための骨の置換材料の評価を可能にする。
このモデルは、成熟した骨の上の新しい骨組織の異所性成長を測定するので、骨再生を評価するために非常に重要である。従来のモデルと比較すると、人工的に作成された欠陥を埋めるために新しい骨が再生され、最終的に初期レベルに戻ります。ウサギの頭蓋骨に固定された大きなシリンダーを使用することにより、骨伝導、骨誘導、骨形成、および材料によって誘導される血管新生は、生きている動物または犠牲動物のいずれかで評価され得る。
この手順を実証することは、私たちの研究室の研究員であるローリン・マーガーと私です。動物を鎮静した後、静脈内カヌラを耳から限界静脈に入れ、挿管が完了するまで閉じたままにします。ウサギを起こしやすい位置に置き、頭を垂直に伸長させます。
10%リドカインを噴霧して局所的に気管を麻酔する。小径気管チューブを、チューブ内の気流が聞こえるまでウサギの気管に入れます。これは喉頭を開き、決定的な管の挿入を促進する。
次に、管にガイドを挿入して、管の位置を気管に固定します。小径チューブを取り外し、ガイドの決定的気管チューブをスライドさせます。ガイドを取り外し、気管チューブの端にあるバルーンを膨らませて、デバイスを気管に密封してブロックします。
鎮痛を誘発するためにフェンタニルを絶えず多量にする。プロポフォール1キログラムあたり2〜4ミリグラムの麻酔を誘発し、等体積状態を維持するために酢酸リン酸1キログラムあたり4ミリリットル。すぐに純粋な酸素で3%セボフルランで動物を換気します。
まず、手術台の上に摂氏39度に設定された加熱パッドの上にウサギを置き、直腸温度プローブを置きます。頭皮を剃る。10%プロビドワンヨウ素で皮膚をスクラブし、サイトを消毒します。
その後、無菌の外科用ドレープでウサギをドレープし、頭蓋骨のアクセス領域を切り取る。手術部位を10%プロビドネヨウ素で2回目に消毒する。まず、頭蓋骨にリドカインを皮下注射して局所麻酔をする。
メスを使用して、軌道から外部後頭部突起まで、カルバリア矢状線に沿って皮膚を切開し、骨膜が切開されていることを確認します。ペリオステルエレベーターを使用して、切開の両側の骨膜を静かに高めます。滅菌生理食糸でサイトをすすいします。
まず、頭蓋骨のメディアとコロナ縫合糸を見つけます。これらの解剖線は十字を形成していることに注意してください。円柱は、クロスによって定義された各象限に配置され、シリンダーのエッジが縫合線の上にないことを保証します。
最初のシリンダーを左上象限に置き、デバイスをできるだけ平らにします。抵抗が感じられるまで、強い手圧でシリンダーの位置を固定し、マイクロスクリューでネジを固定します。スクリューヘッドがシリンダータブと一緒にフラッシュされていることを確認します。
シリンダの他のタブを同じ方法で固定して、シリンダを頭蓋骨にしっかりと固定します。シリンダーが骨に密着して固定されていることを確認します。次に、この手順全体を繰り返して、他の 3 つの作業領域のそれぞれにシリンダを固定します。
まず、シリンダが取り外す領域の中心にある骨に丸いバリを付けて生理食水の下で中間穴を開けます。出血が見えるようにしてください。次に、円柱の内側のエッジにある 2 つのタブ ねじを通過する軸に沿って、さらに 2 つの中間穴をドリルします。
垂直軸に沿って、円柱の内側のエッジでさらに2つの中間穴を開けます。他の 3 つのシリンダに対してこのドリル処理を繰り返します。次に、最初のシリンダーを材料サンプルでつばに充填します。
キャップを取り付け、円柱を閉じます。他の 3 つのシリンダについても、この充填処理を繰り返します。断続的な不蘇生縫合糸でシリンダーの上の皮膚を閉じ、創傷にスプレー可能なドレッシングを適用します。
この後、鎮痛と麻酔の供給を停止し、自律呼吸の回復を確認します。動物が自律呼吸を回復したら、換気を停止します。完全な目覚めの前に純粋な酸素の下で動物を維持します。
ブプレノフィン塩酸塩を皮下に注入する。手術後の鎮痛として3日間、6時間ごとに注射を繰り返す。動物が完全に目を覚ましてから、水と完全な給餌で通常の住宅に移します。
このビデオで説明するモデルは、骨の代用における骨伝導、骨誘導、骨形成、および新生血管形成の評価に特化しています。手術が完了すると、生きている動物の骨断層撮影を使用して、異なる時点で骨の成長を監視することができます。追加の分析は、動物を犠牲にする必要があります。
安楽死後、サンプルを切り離し、シリンダーを慎重に取り除きます。生検は、その後、PBSで4%ホルムアルデヒドの溶液で固定されます。この後、マイクロトモグラフィーは骨の成長を評価するために使用され得る。
サンプルは、組織学的染色のために処理することもできる。ヒストモルフォメトリクス分析と特定の染色は、より具体的に分析を完了することが可能です。このプロトコルは外科手術法であるため、すべてのステップは重要であり、適切に従わなければなりません。
動物実験、特にウサギの取り扱いや麻酔の訓練を受ける事が重要です。記載された方法とは別に、細胞はフローサイトメトリーを用いてより特異的に分析され得る。材料進化、骨組織成熟、および力学はまた、例えばナノのくぼみを用いて評価され得る。
このモデルの助けを借りて、多くの評価が行われました。例えば、チタンまたはセラミックケージについては、GBM膜、骨形成因子、新生児置換基、または骨再生プロセス中の新生血管形成のメカニズムが挙げられる。
