Aqui apresentamos um protocolo cirúrgico para coelhos com o objetivo de avaliar materiais de substituição óssea em termos de capacidades de regeneração óssea. O princípio básico deste modelo de calvarial de coelho é cultivar um novo tecido ósseo verticalmente em cima da parte cortical do crânio. Este modelo permite a avaliação de materiais de substituição óssea para regeneração óssea oral e craniofacial em termos de suporte ao crescimento ósseo e suporte à neovascularização.
O modelo é altamente significativo para avaliar a regeneração óssea, pois mede o crescimento ectópico de um novo tecido ósseo acima do osso maduro. Quando comparado com os modelos tradicionais, em que o novo osso se regenera para preencher defeitos que foram criados artificialmente para finalmente voltar ao seu nível inicial. Usando cilindros grandes fixados em crânios de coelho, osteocondução, osteoindução, osteogênese e vasculargênese induzida pelos materiais podem ser avaliados em animais vivos ou sacrificados.
Demonstrando o procedimento estará Laurin Marger, uma pesquisadora associada do nosso laboratório, e eu. Após sedar os animais, coloque uma cânula intravenosa na veia marginal da orelha e mantenha-a fechada até que a intubação esteja completa. Coloque o coelho na posição propensa e mantenha a cabeça na extensão vertical.
Anestesiar a traqueia localmente pulverizando 10% de lidocaína. Deslize um tubo endotraqueal de pequeno diâmetro na traqueia do coelho até que o fluxo de ar possa ser ouvido no tubo. Isso abrirá a laringe e facilitará a inserção do tubo definitivo.
Em seguida, insira uma guia no tubo para fixar a posição do tubo na traqueia. Remova o tubo de pequeno diâmetro e deslize o tubo endotraqueal definitivo na guia. Remova a guia e infle o balão no final do tubo endotraqueal para selar e bloquear o dispositivo na traqueia.
Fentanil continuamente profuso para induzir analgesia. Dois a quatro miligramas por quilograma de propofol para induzir anestesia e quatro mililitros por quilograma por hora de acetato de ringadores para manter condições isovolumétricas. Ventile imediatamente o animal com 3% de sevoflurano em oxigênio puro.
Primeiro, coloque o coelho em uma almofada aquecida a 39 graus Celsius na mesa de cirurgia, e coloque a sonda de temperatura retal. Raspe o couro cabeludo. Esfregue a pele com iodo de 10% providone para desinfetar o local.
Em seguida, drapear o coelho com uma cortina cirúrgica estéril e cortar uma área de acesso do crânio. Desinfete o local cirúrgico com iodo de 10% providone pela segunda vez. Para começar, anestesiar localmente com uma injeção subcutânea de lidocaína no crânio.
Use o bisturi para incisar através da pele ao longo da linha sagital calvarial das órbitas até a protuberância occipital externa, certificando-se de que o periosteum seja incisivo. Use um elevador periosteal para elevar suavemente o periósteo em ambos os lados da incisão. Enxágüe o local com soro fisiológico estéril.
Primeiro, localize a mídia e as suturas coronais no crânio. Note que essas linhas anatômicas formam uma cruz. Os cilindros serão colocados em cada um dos quadrantes definidos pela cruz, garantindo que a borda do cilindro não esteja sobre a sutura.
Coloque o primeiro cilindro no quadrante superior esquerdo colocando o dispositivo o mais plano possível. Fixar a posição do cilindro com forte pressão da mão e parafuso em um micro parafuso até sentir a resistência. Certifique-se de que a cabeça do parafuso está alinhada com a aba do cilindro.
Conserte a outra guia do cilindro da mesma forma para fixar o cilindro firmemente no crânio. Certifique-se de que o cilindro está hermeticamente fixado ao osso. Em seguida, repita todo este procedimento para fixar um cilindro em cada um dos outros três quadrantes.
Para começar, faça um buraco intermeduário sob irrigação salina com uma rebarba redonda no osso no centro da área circunscrita pelo cilindro. Certifique-se de que o sangramento apareça. Em seguida, perfurar mais dois orifícios intermedulares ao longo do eixo passando pelos dois parafusos de aba nas bordas internas do cilindro.
Ao longo do machado perpendicular, faça mais dois orifícios intermeduriais nas bordas internas do cilindro. Repita este processo de perfuração para os três outros cilindros. Em seguida, encha o primeiro cilindro até a borda com a amostra do material.
Feche o cilindro encaixando a tampa. Repita este processo de enchimento para os outros três cilindros. Feche a pele acima dos cilindros com uma sutura intermitente não resorbável e aplique um curativo pulverizado na ferida.
Depois disso, pare o fornecimento de analgesia e anestesia e verifique a recuperação da respiração autônoma. Uma vez que o animal tenha recuperado a respiração autônoma, pare a ventilação. Mantenha o animal sob oxigênio puro antes de acordar completamente.
Injete hidrocloridido de buprenofina subcutâneamente. Repita a injeção a cada seis horas durante três dias como analgesia pós-cirúrgica. Deixe o animal acordar completamente antes de transferi-lo para sua carcaça habitual com água e alimentação completa.
O modelo descrito neste vídeo é dedicado à avaliação da osteocondução, osteoindução, osteogênese e neovascularização em substitutos ósseos. Uma vez concluída a cirurgia, o crescimento ósseo pode ser monitorado em diferentes momentos usando tomografia óssea em animais vivos. Análises adicionais exigem que os animais sejam sacrificados.
Após a eutanásia, as amostras são seccionadas e os cilindros são cuidadosamente removidos. As biópsias são então corrigidas com uma solução de 4% de formaldeído na PBS. Depois disso, a microtomografia pode ser usada para avaliar o crescimento ósseo.
As amostras também podem ser processadas para coloração histológica. Análise histomorfométrica e manchas específicas são então possíveis para completar a análise mais especificamente. Como este protocolo é um método cirúrgico, todas as etapas são críticas e devem ser seguidas adequadamente.
É importante ser treinado para experimentos com animais, especialmente no manuseio de coelhos e anestesia. Além dos métodos descritos, as células podem ser analisadas mais especificamente usando citometria de fluxo. A evolução do material, a maturação do tecido ósseo e a mecânica também podem ser avaliadas usando o recuo de nano, por exemplo.
Com o auxílio desse modelo, muitas avaliações foram realizadas. Como por exemplo, para gaiolas de titânio ou cerâmica, membranas GBM, fatores osteogênicos, substitutos recém-nascidos ou o mecanismo de neovascularização durante o processo de regeneração óssea.
