焦点を合わせるイオンビームリソグラフィー(FIB)を使用することで、研究者は生体適合性を高め、ネイティブ組織との統合性を高めた材料表面を設計することによって、細胞表面相互作用を改善することができます。FIBを使用すると、シリコン、金属、ポリマーなどのさまざまな材料に特徴をエッチングすることができます。非平面サーフェスも使用でき、後処理は個々のデバイスで実行できます。
一般に、この方法は他の顕微鏡でも使用できる。しかし、異なる顕微鏡メーカーは、各システムに最適化する必要があり、パターニングソフトウェアのユニークなバージョンを持っています。手順を実証すると、私の研究室の大学院生であるシュレヤ・マハジャンさんになります。
取り付けの準備のために、シリコンプローブのきれいなストリップを慎重に拾うために細かい穴の真空鉗子を使用してください。走査型電子顕微鏡FIBイメージングおよびエッチングに使用されるクリーンなアルミニウムスタブの上に置きます。つまようじを使用して、プローブを囲むシリコン基板の端に銀色塗料の小さな滴を置きます。
プローブを囲むシリコン基板の側面に銀色塗料を広めることで、ストリップを固定します。アルミニウムスタブをSEM FIBに入れる前に、銀色の塗料を完全に乾燥させます。次に、ビームコントロールタブのベントボタンをクリックして、SEM FIBチャンバーをベントします。
F3 キーを押してホーム ステージを実行します。ポップアップウィンドウで「ホームステージ」ボタンを選択して、選択内容を確認します。ホームステージが完了したら、X=70ミリメートル、Y=70ミリメートル、Z=0ミリメートル、T=0度、R=0度の座標にステージを移動します。
チャンバーが通気したら、きれいなニトリル手袋を着用し、チャンバードアを開けます。プローブを保持するアルミニウムスタブをステージアダプタの上部に挿入します。ステージアダプターの側面にあるセットねじを締めて、アルミ・スタブを固定します。
高さが適切に調整されていることを確認します。このタスクには 1.5 ミリ 16 進数レンチを使用します。ナビゲーションカメラのアームを慎重に振り開けて停止します。
顕微鏡ステージは自動的にカメラの下の位置に移動します。顕微鏡ユーザーインターフェイスのクアドラント3に示すライブ画像をご覧ください。輝度レベルが適切なレベルに自動調整されたら、カメラブラケットのボタンを押して画像を取得します。
これには約 10 秒かかります。カメラアームを閉じた位置に戻します。ステージは元の位置に戻ります。
顕微鏡室のドアを慎重に閉じます。ドアを閉めながら、クアドラントフォーのCCDカメラ画像を見てください。サンプルとステージが顕微鏡室の重要なコンポーネントから安全な距離にあることを確認します。
チャンバー真空ポンプと内蔵プラズマクリーナーを起動するには、ユーザーインターフェイスソフトウェアのサンプルクリーニングボタンを選択します。顕微鏡室のポンプ時間とプラズマ洗浄サイクルが完了するまで約8分間待ちます。ユーザー インターフェイスの右下隅にあるアイコンが緑色になったら、ビーム コントロール タブの [ウェイクアップ] ボタンを押して、電子ビームとイオンビームをオンにします。
[象限 1] を選択し、ビーム信号を [電子ビーム] に設定します。次に、象限 2 をイオンビームに設定します。SEM 電圧を 5 キロボルト、SEM ビーム電流を 0.20 ナノアンプ、SEM 検出器から ETD、検出器モードを二次電子に設定します。
FIB電圧を30キロボルト、FIBビームを24ピコアンプ、FIB検出器をICE検出器に、検出器モードを二次電子に設定します。ナビゲーションカメラ画像のシリコンプローブをダブルクリックし、クアドラントスリーをダブルクリックして、ステージをプローブのおおよその位置に移動します。[象限 1] をクリックしてアクティブな象限として選択し、一時停止ボタンを押して SEM スキャンを開始します。
スキャンのドウェル時間を 300 ナノ秒に設定し、スキャン インターレース、ラインインテグレーション、フレーム平均化をオフにします。[ビームコントロール]タブで、[スキャン回転]をゼロに設定します。ビームシフト2Dアジャスターを右クリックし、ゼロを選択します。
顕微鏡のユーザーインターフェイスパネルで倍率ノブを反時計回りに回して、倍率を最小値に調整します。ユーザーインターフェイスパネルのノブまたは自動コントラストの明るさツールバーアイコンを使用して、画像の明るさとコントラストを調整します。ステージを移動するには、フィーチャ上でマウスをダブルクリックして中央に配置します。
次に、パターン化する目的のシリコンプローブをSEM画像の中央に移動します。エッジまたはほこりパーティクルや傷などの他のフィーチャを探します。倍率ノブを時計回りに回して、倍率を2000倍に増やします。
画像が焦点を合わせるまで、顕微鏡のユーザーインターフェイスで粗い、細かいフォーカスノブを回すことによって、SEMの焦点を調整します。イメージにフォーカスが置いたら、ツールバーの「サンプル Z を作動距離にリンク」ボタンを選択します。ナビゲーションタブでZ軸座標を見て、操作が完了したことを確認します。
値は約 11 ミリメートルにする必要があります。Z 軸の位置に 4.0 ミリメートルを入力し、マウスで [移動] ボタンを押します。XとYでステージを動かして、シリコンプローブの肩を見つけます。
可能な限り SEM の中心に近づけます。T座標に52を入力してステージの傾きを52度に変更し、Enterキーを押します。
ステージ Z スライダーを使用して、プローブの肩を SEM イメージの中央に戻します。Z 位置を調整するだけです。X、Y、T、または R 軸は移動しないでください。
ステージのドロップダウンメニューにある組み込みの XT 位置合わせ機能を実行します。マウスを使用して、プローブの端に平行な2つの点をクリックします。ポップアップウィンドウで水平ラジオボタンが選択されていることを確認し、「完了」をクリックします。
ステージは、プローブをステージの X 軸に合わせて回転します。マウスを使用してプローブの下肩をSEM画像の中央に再び配置して、XYのステージを調整します。[象限 2] で FIB を選択し、ビーム電流が 24 ピコアンプであることを確認します。
倍率を 5000X に、ドウェル時間を 100 ナノ秒に設定します。キーボードの Control-F と入力して、FIB フォーカスを 13 ミリメートルに設定します。[ビームコントロール]タブで、スティグマ2Dアジャスターを右クリックし、ゼロを選択します。
また、ビームシフト2Dアジャスターで右クリックし、ゼロを選択します。スキャンの回転角度をゼロ度に設定し、ツールバーの自動コントラストの明るさボタンをクリックします。象限 2 でプローブ ショルダーの画像を探します。
スナップショット ツールを使用して、FIB 内のイメージを取得します。プローブショルダーがFIB画像の中央にあるか確認します。それでない場合は、プローブの肩をダブルクリックして中央に移動します。
キーボードの左矢印キーを約10~15回押してステージを左に動かします。別のスナップショットを作成し、プローブ側が FIB の中央にまだあるかどうかを確認します。これらのステップを繰り返して、プローブショルダーのエッジがステージのX軸に完全に揃えるまで、FIBを使用して、ステージをプローブの下肩に戻します。
[追加]ボタンをクリックして、ステージの位置をポジションリストに保存します。FIBビーム電流を2.5ナノアンプに変更し、FIBの倍率がまだ5000Xであることを確認します。自動輝度コントラスト機能を実行し、FIBのドウェル時間を100ナノ秒に設定します。
一時停止ボタンを押してスキャンを開始します。ユーザーインターフェイスパネルの粗い、細かいフォーカスノブとXとYのスティグマノブを使用して、FIBの焦点と乱視をできるだけ迅速かつ正確に調整します。一時停止ボタンを押して FIB スキャンを停止します。
Nanobuilder ソフトウェア内で、シリコンプローブのパターン化用のファイルを開きます。[顕微鏡]ドロップダウン メニューを選択し、[ステージの原点を設定]を選択します。[顕微鏡] ドロップダウン メニューを選択し、[検出器のキャリブレーション] を選択します。
顕微鏡のユーザーインターフェイスで、マウスでクアッドワンを1回クリックしてQuad Oneを選択します。[OK] をクリックして、調整を開始します。この処理には約 5 分かかります。
ETDおよびICE検出器がキャリブレーションされていることを確認してください。ソフトウェア内で、[顕微鏡]ドロップダウンメニューを選択し、[実行]を選択してパターン化シーケンスを開始します。パターンが完成したら、ソフトウェアを閉じます。
顕微鏡のユーザー インターフェイスビーム 制御タブでベントを押して、顕微鏡のビームをシャットダウンし、ベント サイクルを開始します。チャンバーが通出している間、適切な座標にステージを移動します。チャンバーが通気したら、きれいなニトリル手袋を着用し、チャンバードアを引き開けます。
1.5 mm の六進レンチを使用して、スタブ アダプタのセット ネジを緩めます。パターン化されたプローブを含むアルミニウムスタブをチャンバーから取り外します。顕微鏡室のドアを慎重に閉じます。
ドアを閉めながら、クアドラントフォーのCCDカメラ画像を見てください。ステージアダプターが顕微鏡室の重要なコンポーネントから安全な距離にあることを確認します。ここに示されているのは、シャンクの裏側に沿ったFIBエッチングナノアーキテクチャを備えた非機能的なシングルシャンクシリコンプローブのSEM画像です。
エッチングされたナノアーキテクチャの最終的な寸法は、300ナノメートルの間隔を持つ200ナノメートル幅の平行線であり、200ナノメートルの深さを有していた。ナノアーキテクチャをプローブの表面にエッチングすることがインプラントの周りのニューロン密度に与える影響を判断するために、ニューロン核を染色し、定量化しました。ニューロン生存は、インプラント部位から離れた50ミクロンビンの同じ動物の距離から背景領域の割合として提示される。
移植後4週間の滑らかな制御インプラントと比較して、インプラント部位から100〜150ミクロンの距離でナノアーキテクチャプローブの周りに有意に多くのニューロンがありました。また、機能性単一シャンクシリコン微小電極の裏側に沿ってFIBエッチングを行い、電子生理学的測定を定量化し、ナノアーキテクチャのエッチングが電極性能にどのような影響を与えるかを調べた。電気生理学的結果は、滑らかな制御マイクロ電極と比較して、ナノアーキテクチャの微小電極から単一のユニットを記録するチャネルの割合が増加した。
概念実証パイロット研究のために1つだけ移植されたため、ナノアーキテクチャの微小電極に対する統計分析は行われませんでした。FIBエッチングにより、研究者は、医療機器に地形の手がかりを加えて、細胞の応答を改善し、最終的にはデバイスの性能を向上させる方法を調査することができます。FIBは、さまざまな材料、表面形状、そして最も重要なのは既に製造されたデバイスに対して行うことができるため、これらの方法を適用できる医療機器の幅は無限です。
