このプロトコルは、基礎研究のためのプローブまたは潜在的な臨床化合物のためのプローブとして、ATPase阻害剤の開発を目的とした幅広いスクリーニングプロジェクトに適用可能です。この方法は、半ハイスループットスクリーニングアプリケーション用に最適化されています。また、いくつかの一般的なアーティファクトを避けるように設計されており、危険物の取り扱いを必要としません。
私たちの研究室では、メタンフェタミン使用障害の治療のための新しい、特定の非筋肉ミオシンII阻害剤を開発するために、このアッセイを使用しています.理論的には、この方法は、ATPを産生する任意の酵素に容易に適用することができる。視覚的なデモンストレーションは、すべての重要な技術的詳細を明確にするのに役立ちます。
まず、濃縮アクチンストック溶液をアクチンバッファーに希釈して、384ウェル黒ポリスチレンマイクロプレートごとに4,500マイクロモル希釈アクチン溶液を調製します。上下に30回ピペットして溶液を完全に混合し、粘度と不均一性を低下させるアクチンフィラメントを破ります。次いで、溶液を遠心分離し、存在する任意の沈殿タンパク質を除去する。
上清をきれいな遠心管に慎重に移します。骨格筋ミオシンII、LDH溶液171.4マイクロリットル、および171.4マイクロリットルのPK溶液を含むアッセイ用のミオシンバッファー3、252.9マイクロリットルを組み合わせることにより、各アッセイプレート用の15ミリリットル円錐形遠心分離管にマスター酵素ミックスを調製します。15ミリリットルの円錐形遠心分離チューブに、162.1マイクロリットルのATP、162.1マイクロリットルのPEP、および324.1マイクロリットルのNADH溶液を組み合わせて、マスター基板ミックスをプレートごとに用意します。
凝集や沈殿を避けるために、この時点でアクチンを追加しないでください。キャリブレーション用にNADHの7ステップのシリアル1対2希釈を作成するには、8つの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを調製します。12.3マイクロリットルのNADHストック溶液を最初のチューブに257.7マイクロリットルのミオシンバッファーと混合し、250マイクロモル溶液を作ります。
次に、135マイクロリットルのミオシンバッファーを残りの7つのチューブのそれぞれにアリコートする。1番目のチューブから溶液の135マイクロリットルを第2のチューブに移し、ピペットで混合する。7番目のチューブに到達するまで繰り返します。
最後のチューブを、バッファのみで NADH コントロールとして使用します。コンパウンドプレートには正と負のコントロールが常に含まれ、アッセイプレートの校正用NADH希釈剤も含まれます。これらのコントロールは、データ分析中にアーティファクトを識別するうえで非常に重要です。
8チャンネルピペットを使用して、NADHキャリブレーション溶液の20マイクロリットルをアッセイプレートの三倍位に入れ、最初の行に移します。今酵素ミックスに骨格筋ミオシンIIの4.2マイクロリットルを追加します。渦は簡単に。
分剤を出す直前に酵素ミックスにミオシンを加えます。希釈されたミオシン溶液の長いインキュベーションは、沈殿による活性の損失をもたらし、プラスチック表面への非特異的結合をもたらす可能性がある。調製したミオシン酵素ミックスを自動ディスペンサーのサンプル容器の1つにロードします。
プレートでは、最初の行を除き、8.4マイクロリットルのミオシン酵素をアッセイプレートの各ウェルに分配する。次に、アッセイプレートとコンパウンドプレートを、100ナノリットルのピンツールヘッドを装備した自動液体ハンドリングシステムのラボウェアポジショナに配置します。次に、ソフトウェアで適切な方法を実行し、調製した化合物プレートからアッセイプレートに100ナノリットルの溶液を移す。
次に、マイクロプレートシェーカーの上にアッセイプレートを置き、室温で1分、200rpmで振ります。基板ミックスと渦に4,052マイクロリットルの遠心アクチン溶液を簡単に加えます。酵素反応を開始するには、1行目を除く自動ディスペンサーを使用して、11.6マイクロリットルのアクチン基板をアッセイプレートの各ウェルに分配します。
マイクロプレートシェーカーで、アッセイプレートを室温で1、200rpmで1分間振ります。アッセイプレートを101回gで30秒間遠心分離する。アッセイには、380ナノメートル、10ナノメートルのバンド幅励起フィルタ、470ナノメートル、24ナノメートルのバンド幅放出フィルタを425ナノメートルのカットオフ二色ミラーと組み合わせて使用します。
アッセイを実行する前に、フラッシュ、検出器ゲイン、プレート寸法、測定高さの数を最適化します。高濃度モードで測定を実行します。プレートリーダーの内温度が25°Cで安定していることを確認します。
プレートをプレートリーダーにロードし、さらに30秒間振って、各ウェルで液体表面の形状を類似させ、プレートが測定温度に達できるようにします。プレートを45秒間隔でスキャンし、NADH蛍光を30分間記録します。エクスポートされたデータを使用して、観察された蛍光強度を各ウェルの時間に対してプロットします。
単純な線形回帰を実行して、各ウェルの蛍光応答の傾きと切片を決定します。傾斜は、ATP 消費率の非常に良い近似として使用できる NADH の消費率に比例します。切片は、測定開始時のNADH濃度に比例します。
次に、プレートの第1行に対して得られたインターセプトをNADHの濃度に対してプロットしてNADHの較正曲線を構築する。インターセプトは、最初の蛍光強度の読み取りの平均よりもはるかに自信を持って、最初の蛍光強度を推定します。NADHキャリブレーションラインの傾きと切片を取得するために、単純な線形回帰を実行します。
ここで、インターセプトはNADHが存在しない蛍光バックグラウンド信号を説明し、斜面は1モルNADH溶液の外挿された理論的蛍光強度に対応する。蛍光変化をATP消費速度に変換するために、残りのウェルについて得られた蛍光応答の傾きをNADHキャリブレーションラインの傾きで分割します。次に、阻害剤の濃度に対するATP消費率をプロットする。
阻害定数を決定するには、Origin 2017 など、非線形曲線適合が可能な適切な統計ソフトウェアを使用します。単純な 1 対 1 の結合平衡モデルに対応する 2 次方程式に線量応答データを適合させるために、非線形曲線適合を選択します。Y は、ATP 消費率です。
Y-最小は阻害剤の不在時のATP消費率である。Y-最大は、100%阻害での理論的なATP消費率です。tとtは、それぞれミオシン酵素および阻害剤の総濃度である。
KIは、阻害定数である。本研究では、骨格筋および心筋ミオシンII ATPase反応は、使用されたミオシンまたは阻害剤の存在に関係なく、直線的な蛍光強度トレースを示した。基底およびアクチン活性化ATPase率は、骨格筋または心筋ミオシンII.Aスクリーニングウィンドウ係数または0.78のZファクターの濃度に直線的に依存を示し、非常によく分離された陽性および陰性対照を有する信頼できるアッセイを示した。
ブレビスタチン、パラ-アミノブレビスタチン、およびパラニトロブレビスタチンは、報告された溶解度値以下で定期的な用量応答曲線を示した。心臓および骨格筋筋の両方の抑制定数は、データに単純平衡結合モデルを表す二次方程式を適合させることによって決定した。骨格筋ミオシンIIを用いたATPaseアッセイで得られたブレビスタチンの蛍光強度トレースは、存在する阻害剤の量に応じて正常に直線的に減少するシグナルを示した。
しかし、ブレビスタチンの溶解度を上回る信号の予想外の増加は、明るい花性ブレビスタチン結晶の形成に起因する可能性が最も高い。正常生蛍光強度トレースを有するパラニトロブレビスタチンの場合、上記の溶解度は沈殿による測定用量応答曲線から発散した反応速度である。この方法を用いることで、基礎研究の科学的ツールとして、または将来の直接的な候補として使用される可能性のある新しい、強力な、選択的なミオシン阻害剤を開発しました。
実際の陽性ヒットと偽陽性のヒットを区別するために、関心のある酵素に固有の異なるATPaseまたは他の機能アッセイを使用することが常に推奨されます。すべてのタンパク質はプラスチック表面を結合します。この問題は、特にタンパク質が低濃度で存在する場合、結果に大きく影響を与える可能性があります。
不必要な液体の取り扱いを避け、非結合の管を使用する。代替ATPaseアッセイは、通常、硫酸、有毒物質または放射性物質の取り扱いを必要とする。対照的に、NADH結合ATPaseアッセイは、毒性がまったくないか、または非常に低い試薬を必要とします。
