我々のプロトコルは、膜結合パイロホスファターゼの脱活性を阻害する化合物を見つけるためのツールとして機能します。そして、この阻害剤は、いくつかの寄生虫病の治療に使用され得る。このプロトコルは、酵素再活性化に必要な高リン脂質濃度の存在下で干渉を示すことなく、長い時間のための安定した色を生成する安価で簡単です。
再活性化緩衝液10ミリリットルを調製し、PH6.5で20ミリモルM-E-S、体積グリセロールで3.5%容量、2ミリモルD-T-T、および0.05%D-D-Mを含む。反応ミキサー10ミリリットルを調製し、200ミリモルトリス塩酸塩をPH8で含有する。8ミリモル塩化マグネシウム、333ミリモル塩化カリウム、および67ミリモル塩化ナトリウム。
酵素の再活性化のためにミリリットルリポソームあたり30ミリグラムを調製する。まず、10ミリリットルの塩酸トリトリモルをPH 8で加え、大豆から0.3グラムのLアルファホスファチジルコリンを1ミリモルD-T-Tで加える。リポソームを氷の上に置き、1秒間のポストインターバルで1分間超音波処理します。
1 分間一時停止し、透明な黄色になるまで繰り返します。アリコート100マイクロリットルのリポソームは、液体窒素を凍結し、使用されるまでマイナス80°Cで保存します。酵素を再活性化するには、リポソーム溶液を室温で解凍する。
リポソーム溶液40マイクロリットルを20%D-Mの22.5マイクロリットルと混合します。55°Cで15分間保持します。そして、室温まで冷却することができます。
次いで、36.5マイクロリットルの再活性化緩衝液を加える。混合し、1ミリリットルあたり0.13ミリグラムの総濃度を作るために濃縮タンパク質の1マイクロリットルを追加します。次に、再活性化酵素の20マイクロリットルを反応混合物の1480マイクロリットルに移す。
やさしく混ぜてすぐに使います。まず、化合物をD-M-S-Oに溶解し、200マイクロリットルで50ミリモルのストック溶液を作ります。可溶性化合物の場合は、水でストック溶液をマイクロチューブで1ミリリットルに希釈し、2、10、および100マイクロモルを与える。
各希釈について、適切な混合のための化合物溶液を渦液。その後、化合物の発散を確認し、マルチチャネルピペットを使用して、反応混合物の75マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに分配します。各化合物と水の75マイクロリットルを三重でコントロールし、上下に5回ピペットで混ぜます。
マイクロプレートのネフェロメーターを使用して、300ボルトで各ウェルを測定します。クエン酸アルセイン酸溶液を調製するために、アルセイン酸ナトリウム5グラムとクエン酸二水酸三ナトリウム5グラムを重み、両方の化合物を100ミリリットルの水に溶解する。次に、5ミリリットルの氷酢酸を加えます。
混合し、250ミリリットルに水を追加し、光から保護された室温で保存します。次に、氷冷0.5モル塩酸を0.3グラムのアスコルビン酸に10ミリリットル加えて溶液Aを調製し、アスコルビン酸をボルテックスで溶解する。テトラヒドレートアンモニウム四元水性化物の70ミリグラムに氷冷水1ミリリットルを加えて溶液Bを調製し、渦を溶解させる。
溶液AとBを氷の上に保管してください。濃度0、62.5、250、500マイクロモルをキャリブレーション用にリン酸標準を調製した。反応混合物の370マイクロリットルを含む4つのマイクロチューブに、ゼロマイクロリットル、12.5マイクロリットル、50マイクロリットル、および5ミリモルリン酸二ナトリウム二水和物の100マイクロリットルを加えます。
水で1ミリリットルまで上げる。次に、溶液Bの1ミリリットルを10ミリリットルの溶液Aに加え、手で混ぜて氷の上に保存します。マルチチャンネルパイプを使用して、40マイクロリットルのゼロ、62.5、250、500マイクロモルリン酸塩規格を3重のチューブスクリプトに追加します。
次に、化合物溶液25マイクロリットルと各チューブのM-P-P-A溶液混合物15マイクロリットルを加えます。リン酸塩標準を含む管を除く。粘着シールシートでチューブストリップを密封します。
各チューブストリップを分離するためにシールシートをカットします。次に、サンプルを摂氏71度で5分間事前にインキュベートします。各ストリップ間の20秒間隔で加熱ブロックにサンプルを置きます。
各ストリップに対して、接着剤シールを開きます。マルチチャネルピペレットを使用して、ピロリン酸二塩基ナトリウム2モルの100マイクロリットルを加えます。そして、5回上下にピペットで混ぜます。
同じシールを使用して、チューブストリップを再び密封します。摂氏71度で再び5分間インキュベートします。その後、各ストリップ間の間隔20秒で冷却装置上にサンプルを置く。
5分間冷ましてから、各ストリップを遠心分離して、シーリングシートの下に滴を落とします。ストリップを冷却装置に戻し、シールを取り外し、さらに5分間冷却します。その後、60マイクロリットルの溶液AとBを加え、上下にピペットして5回混合し、チューブストリップを冷却装置に10分間保持します。
ヒュームフードに、90マイクロリットルのアルセインクエン酸溶液を加え、室温で最低30分間保ちます。安定した青の色を作り出す。各反応混合物の180マイクロリットルを透明な96ウェルポリスチレンマイクロプレートに分配する。
マイクロプレート分光光度計を使用して、各ウェルの吸光度を860ナノメートルで測定します。このプロトコルでは、8つの化合物を、ピロホスファターゼの一般的な阻害剤であるI-D-Pと共に陽性対照として試験した。溶液A及びBを添加した後、クエン酸のアルセイン酸塩と、室温で30分間のインキュベーションで青色を示す。
非阻害化合物の3つの濃度すべて、同じ青色の色強度を示した。阻害剤を含まずにE-1からE-3に対しても。試験した各化合物の濃度に対する酵素活性のプロットは、阻害活性を有する化合物が非線形曲線フィッティングを形成したことを示す。
正の対照としてのI-D-Pのプロットは、より高い濃度での活性の低下を明らかに示す。化合物1、5、6、7、および8の阻害曲線。1.7マイクロモル、21.4マイクロモル、58.8マイクロモル、239.0マイクロモル、および500マイクロモルを超える200マイクロモルで、半分の最大阻害濃度を示す。
M-P-P-Aソリューションを準備することを忘れないでください。アッセイの始まり直前。
