マサリマイシンは、細菌細胞の増殖を停止する細菌性オートライシンの数少ない阻害剤の1つです。これは、自己分解の化学的および遺伝的不活性化の違いを調査するために使用することができ、細菌生理学を研究するための遺伝学への直交アプローチを提供する。マサリマイシンの合成は困難に思えるかもしれません.
表示される手順に厳密に従ってください。反応ステップが機能したかどうか疑わしい場合は、薄層クロマトグラフィーでRF値の変化を確認してください。開始するには、シクロヘキシルアミン、シクロヘキシルカルボキシアルデヒド、オルトヨード安息香酸、およびシクロヘキシルイソシアン化物の0.1モル溶液をメタノール中に調製する。
マグネチックスターラーバーを加え、次いで、キャップ付き丸底フラスコに5ミリリットルのシクロヘキシルアミンおよび5ミリリットルのシクロヘキシルカルボキシアルデヒドを混合し、フラスコをホットプレートスターラー上の砂浴中に40°Cで30分間置く。砂面から約1cm下に温度計を設置して温度を監視します。30分後、5ミリリットルのシクロヘキシルイソシアン化物を溶液に加え、摂氏50度でさらに20分間撹拌する。
次いで、反応混合物に5ミリリットルのオルトヨード安息香酸を加え、摂氏55度で3〜5時間撹拌し続ける。3時間の撹拌後、約1時間間隔で薄層クロマトグラフィー(TLC)により反応の進行を定期的にモニターする。TLCプレート上に保持率が0.3に等しいスポットが1つだけ見える場合、反応が完了していると考えてください。
減圧下で回転式蒸発器で溶媒を除去する。すべてのメタノールが蒸発したら、乾燥粗生成物を30ミリリットルの酢酸エチルに溶解し、それを分液漏斗に移す。1モルの塩酸で酢酸エチルを順次抽出し、水、飽和重曹水、再度水、飽和塩化ナトリウム水溶液とし、各抽出にて水層を廃棄した。
次いで、分液漏斗から酢酸エチル層を除去し、三角フラスコに集める。無水硫酸ナトリウムでいっぱいのヘラを加え、酢酸エチルから残留水を除去した。乾燥した酢酸エチル溶液をナンバーワンろ紙でろ過し、硫酸ナトリウムを除去した。
その後、ろ紙を少量の酢酸エチルで洗浄する。濾過した酢酸エチル溶液を減圧下回転式エバポレーターで蒸発乾固し、酢酸エチルが全て除去され一旦油状物としてマサリマイシンを得た。マサリマイシン油を1〜2ミリリットルの9:1ヘキサンからイソプロパノール溶液に溶解し、化合物全体が溶解するまでマグネチックスタープレート上で攪拌する。
溶解したマサリマイシンを精製するには、12グラムの順相シリカフラッシュカラムでフラッシュクロマトグラフィーを行います。フラッシュカラムを10カラム容量の移動相で平衡化し、毎分15ミリリットルの流量に設定した機器を使用します。平衡化が完了した後、溶解したマサリマイシンを5ミリリットルのシリンジを用いて引き抜く。
シリンジを平衡化フラッシュカラムの上部に直接接続し、溶液をカラムに注入する。装填したカラムをフラッシュクロマトグラフィーシステムに再接続し、グラジエント溶出を開始します。12カラム容量にわたってイソプロパノールへの最終移動相濃度10:90ヘキサンへのグラジエント溶出を使用してカラムからマサリマイシンを溶出する。
230および254ナノメートルでの吸収を介してマサリマイシンの溶出をモニターする。形態学的研究のために、37°CのLB寒天プレート上で枯草菌11774を増殖させる。その後のすべての実験において、600ナノメートルでの光学密度が1に達するまで、5ミリリットルのLBブロス中で増殖させた第二継代細胞を使用する。
次に、ピペットを用いて、標識処理した培養チューブにマサリマイシンを終濃度3.8マイクロモル添加する。標識対照の培養チューブに対して、等量のDMSOを添加する。サンプルを摂氏37度のインキュベーターに入れ、150RPMで振とうしながら90分間置く。
90分後、培養培地と固定緩衝液の1:10混合物中で培養物を摂氏4度で一晩化学的に固定する。翌日、ピペットを使用して、10~20マイクロリットルの化学固定サンプルをガラス顕微鏡スライドに塗布し、風乾させます。その後、ブンゼンバーナーを用いてスライドガラスを加熱して風乾したサンプルを加熱固定する。
熱固定後、サンプルを100マイクロリットルの0.1%メチレンブルーで染色する。染色剤と共に10分間インキュベートした後、余分な色素を蒸留水で洗い流す。その後、染色されたスライドをオーブン中で摂氏60度に15〜20分間穏やかに加熱し、細胞を共通の焦点面に連れて行く。
染色された細胞の上に顕微鏡カバースリップを置くことによって染色されたサンプルをシールする。次いで、顕微鏡スライドセメントを用いて縁部を密封する。密封した顕微鏡スライドを顕微鏡ステージに置き、明視野顕微鏡を用いて100倍の倍率で画像に焦点を合わせます。
顕微鏡スライドに液浸油を一滴置き、1000倍の倍率で視野を合わせます。顕微鏡に取り付けられたカメラとそれに関連するソフトウェアを使用して顕微鏡写真を取得します。ソフトウェアのオートホワイトバランスと絞り設定を使用して画像を取得します。
フラッシュクロマトグラフィーは、高純度のマサリマイシンの迅速な精製を可能にする。肺炎菌におけるATPase阻害剤オプトチンとの相乗効果または拮抗作用の評価をここに提示する。細菌増殖を阻害する化合物の最低濃度は、青色で示され、共薬の存在下での最小阻害濃度値と考えられる。
対照的に、ピンク色の井戸は細菌の増殖を示す。最小阻害濃度の0.75倍のマサリマイシンを用いた表現型アッセイは、B.subtilisのソーセージ様表現型およびS.pneumoniaeの凝集表現型を実証した。反応の温度に注意してください。
TLCで監視して反応が完了していることを確認します。この方法は、蛍光標識抗生物質と組み合わせて使用して、顕微鏡観察によって細胞壁の変化を調べることができる。
