このプロトコルは、組織スライス内の個々のニューロンに電気ノイズを直接適用する最初のデモンストレーションの1つです。電気刺激に対する神経の反応を観察するために。この技術の主な利点は、個々のニューロンに対する特定の刺激パラメータのセットを評価できることです。
この技術は、特定の機能的な神経細胞タイプを標的とする刺激パラメータの最適化を可能にする。これは、バランスの機能の改善のためのより良い治療薬の開発に影響を与えます.脳幹抽出を開始する前に、CARPOGENを使用して平衡s-ACSFを使用し、氷のスラリーが形成されるまで25分間マイナス80度で溶液を冷却します。
溶液が冷やした後、3〜5週齢のC-57ブラックシックスマウスの頭蓋骨に矢状の皮膚切開を行うために数22の丸みを帯びたカミソリブレードを使用し、矢状縫合に沿ってラムダから始まる小さな切開を行うために標準的なパターンハサミの尖った端を使用します。浅い曲がりのピアソン・フォン・ジュールのペアを使用して、修復された頭頂骨と外皮骨を慎重に反射し、氷冷s-ACSFで脳を浴びる。その後、頭頂部の前頭膜外硫黄を切り取り、尾頭陰性陰性で切り取るために11直鎖状カミソリの刃を使用して前脳とその骨の包みから脳幹を分離する。
孤立した脳幹腹側を浸透的に切断した台形ポリスチレンブロックに取り付け、ティッシュペーパーを使用して、解剖された組織の周りから余分な液体を取り除きます。シアノアクリル酸接着剤を使用して、ポリスチレンブロックを切断段階に固定し、脳幹のrostralとダウンします。MVNの200マイクロメートル横切りスライスを得るためには、毎秒0.16ミリメートルの高度な速度と3ミリメートルの振動振幅を使用してください。
次に、プラスチック製のトリミングされたピペットを使用して、組織スライスを少なくとも30分間摂氏25度で焼成したフィルターペーパーディスクに移します。全細胞パッチクランプ電気生理学の場合、まず、カリウムベースの内部溶液で満たされ、お風呂に入れられたときに3〜5メガOmsの範囲の最終的な抵抗を持つマイクロピペットを引っ張ります。MVN内の個々のニューロンから全細胞パッチクランプ記録を得るために、インキュベーションチャンバーから標準的な電気生理学的セットアップの記録室に単一の組織スライスを移し、U字型の重量のナイロン糸を使用してスライスを固定します。
1分間に3ミリリットルの流量で25°CのカーボンギナードACSFで記録チャンバーを継続的に浸透させ、マイクロピペットに内部溶液を充填します。ピペットを使用して少量の正圧を適用し、破片をピペットチップから押し出します。低電力の目標を使用して、MVN内の個々のニューロンを見つけるために、高出力に切り替える前にMVNを見つけます。
ピペットで組織を破る前に、少量の正圧を適用して破片をピペット先端から押し出し、マイクロマニピュレータを使用してピペットを選択したニューロンに向かって移動させます。小さなディンプルは、神経膜上に形成する必要があります.正圧を放し、少量の負圧を加えます。
1ギガオムシールが達成されたら、膜を破裂し、全細胞構成を作成するために吸引ポートを通してピペットホルダーに穏やかな短く、鋭い負圧を適用します。次に、標準プロトコルに従って全セル電流クランプ記録を取得します。個々の内側前庭核ニューロンに確率的および正弦波ノイズを適用するには、振幅の範囲を3~24ピコの範囲に設定して、ニューロンの閾値と発火率を決定し、より高い刺激強度と低い刺激強度をグループ化してセンサーの閾値を決定します。
次に、10秒の期間における平均焼成率を計算し、その間に脱分極電流ステップが個々の電流レベルごとに注入される。平均発射率値を使用して、発射率と現在のプロットを生成します。次に、線形回帰分析を実行して、ニューロンのゲインを決定するために最適な線の勾配を決定します。
鼻波ノイズも確率的ノイズも、ノイズ記録を制御しないのに対してMVNニューロンのバジル発火率を変化させることはありません。この実験では、選択した6ピコアンプのノイズレベルはサブ閾値であり、12ピコアンプの実験閾値から平均焼成速度が増加し始めることが観察できる。この閾値は、実験閾値の上下の刺激レベルをグループ化することによって客観的に決定した。
ニューロンのゲインは、ニューロンをノイズの有無にかかわらず10ピコアンプインクリメントでゼロから50ピコアンプの一連の脱分極電流ステップに当てにより評価した。実際、6ピコアンプのサブ閾値振幅で適用される正弦波および確率的ノイズは、MVNニューロンのゲインを変化させる可能性があります。確立された刺激パラメータは、より自然主義的な刺激を提供するために、個々のニューロンを活性化する神経に適用することができます.
