多くの神経疾患における神経否定は、細胞の身体喪失の前にしばしば神経線維喪失が起こる慢性プロセスである。3次元の神経線維の立体的定量化は、早期の神経変性変化を検出するための敏感で正確な方法を提供する。この技術は、スペースボールの信頼性と効率的なコンピュータベースの公平な分別を利用して、3Dの神経線維のような線状の構造の長さを測定します。
この手順のデモンストレーションは、ポストドクでステテロロジーの専門家であるプラバカール・シンと、私の研究室の研究アシスタントであるデビッド・ペンによって行われます。麻酔マウスのペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、約50ミリリットルの氷冷0.1モルDPBSを経頭方向に透過し、続いて0.1モルPBSで約25ミリリットルの4%PFAを続ける。灌流の終わりに、摂氏4度で24時間新鮮な4%PFAの容器に脳を後固定する。
翌日、洗い込みごとに新鮮なDPBSで3回1〜2分の洗浄で脳を洗い、脳を一晩で0.1 DPBS溶液で15%スクロースに移します。翌朝、脳を30%スクロース溶液に入れ、摂氏4度で48時間0.1モルDPBSを入れます。インキュベーションの最後に、脳を低温室に移し、マイナス20度に設定します。
脳は密閉チューブに保管し、マイナス80°Cで保存することができます。切削のために、最適な切断温度埋め込み媒体にティッシュサンプルを埋め込み、試料ディスクにサンプルを取り付ける。その後、クライオトームのコロナ平面で30マイクロメートルの厚さの連続セクションを取得し、マイナス20°Cの貯蔵に備えて、凍結保護剤溶液を含む24ウェル培養プレートの個々の井戸に各セクションを移管する。
各脳の最初と最後のセクションを識別するには、標準的なマウス脳アトラスと形態学的特徴を比較します。NBM はブレグマから 0.0 ミリメートルを引いたから始まり、マイナス 1.6 ミリメートルで終了します。8番目のセクションを選択すると、合計6〜7個のセクションが生成され、体積と繊維長の両方の推定に適切な誤差係数が得られます。
組織切片の免疫組織化学的標識の場合、トリス緩衝生理食動物中の0.1%トリトンX-100で10%正常ウシ血清による非特異的結合を遮断した後、摂氏4度で48時間対象の一次抗体を切片に標識する。インキュベーションの終わりに、洗浄ごとに新鮮なトリス緩衝生理食動物で3分間セクションを3回洗浄し、続いて室温で1時間適切なビオチン化二次抗体をインキュベートします。インキュベーションの最後に、実証されているように新鮮なトリスバッファー生理食い物で3回セクションを洗浄し、続いてメーカーのプロトコルに従ってアビジンビオチンペルオキシダーゼ複合体およびDABペルオキシダーゼ基質溶液で染色します。
洗浄後、1つの脳組織サンプルのすべての切片を1つのゼラチン化スライドに取り付け、サンプルを空気乾燥させます。セクションを脱水するには、示されているように、サンプルを1希釈あたり5分間、順次上昇エタノール溶液に浸し、続いて2回10分間のキシレンを溶解してクリアします。次に、適切な取り付け媒体を使用して、スライド上にカバーリップを配置します。
ステレロジーのために、ソフトウェアの新しい研究を開きます。スタディの初期化ダイアログボックスが開きます。スタディ情報を入力し、複数レベルの分数ベースが選択されていることを確認します。
ボリュームをダブルクリックして、音量ダイアログボックスを開きます。対象のフィーチャに名前を付け、リージョン ポイント カウント プローブを選択して、[次へ] をクリックします。長さをダブルクリックし、フィーチャーの名前を指定します。
球プローブを選択し、[次へ]をクリックします。ケース初期化ボックスで、スタディを開始する前にグループをコーディングするには、対象領域を含む最初のセクションから、対象領域とセクションサンプリング間隔を含む最後のセクションまでのセクションの総数を 8 に設定します。次をクリックしてプローブ初期化ダイアログボックスを開き、リージョンの選択と体積の推定値の最小倍率を自動的に設定し、設定を確認します。
[プレビュー]をクリックして、選択した低倍率で対象領域を識別できるかどうかを確認します。領域の体積分率にポイントあたり 50,000 マイクロメートルの立方体を入力し、[プレビュー]をクリックして完了します。[オブジェクトの高倍率]の下で、長さを 63 倍に設定し、ダブルクリックすると、長さの球体ダイアログ ボックスが開きます。
この球の直径を10マイクロメートルに設定し、クリックします。フレーム領域、フレームの高さ、ガード ゾーン、およびフレーム間隔に適切な値を設定します。次へをクリックし、ソフトウェアによって提供される指示に従います。
最初のセクションを挿入するには、スライドを 5X の目的の下で顕微鏡のステージに配置し、緑色の矢印をクリックして NBM の周囲に任意の境界を描画して対象領域を定義します。緑色の矢印をクリックして、63Xの目標を変更して、現在の分数のファイバー測定値を取得します。セクションの太さダイアログボックスが表示されます。
手動z軸フォーカスノブを使用してセクションの実際の厚さを測定するためにセクションの上面と下面を設定し、完了をクリックします。断面のフレーム高さで Z 軸を上から下にゆっくりと移動して、仮想球プローブの表面上のすべての交差するファイバーをマークします。すべてのファイバーがマークされたら、次の位置に進むには、次のボタンをクリックします。
すべての分数が完了したら、緑の矢印をクリックします。ソフトウェアは、次のセクションを挿入するように求めます。スライド上の次のサンプルを5Xの目的を使用して焦点を合わせ、ちょうど実証したようにファイバー測定を繰り返します。
すべてのセクションが測定されると、エラー値の係数を示すケースの結果が生成されます。誤差係数が許容される場合は、次のケースに進みます。エラー係数が許容されない場合、ソフトウェアは、いくつかのパラメータを変更するための推奨事項を提供します。
すべてのケースが完了したら、各ケースとグループの結果を生成します。この代表的な実験では、スウェーデンの変異型βアミロイド前駆体タンパク質群は、野生型のごみ合致物と比較して、繊維長および繊維長密度が有意に低い結果を示した。結果はまた、分析された2つのグループ間のNBMの体積に有意な差がないことを示した。
この技術は、適切な方向での取得とインキュベーション期間と良好な染色方法を必要とします。ステレロジープロトコルは、他の神経線維、アストロサイトプロセス、あるいは血管プロファイルなどの線形プロファイルの推定に使用できます。
