電子チャイミング マクロファージは非自己起源の分子を検出することに特化しているため、特にトランスフェクトが困難です。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いて、一次マクロファージのトランスフェクションを高効率に行えるプロトコルについて説明する。我々の方法の主な利点は、高いトランスフェクション率が検出可能な細胞毒性または免疫原性の不在で達成されるということです。
手順を実証することは、私の研究室からのポスドクであるマーク・ハーブになります。まず、RNA転写キットのすべての成分を解凍します。試薬を5秒間ボルテックスし、2,000回gで2秒間回転させ、使用するまで氷の上に置きます。
原稿の指示に従って0.5マイクロ遠心チューブでインビトロRNA転写反応を準備します。チューブを渦し、それを回転させます。その後、サーマルミキサーで400rpmで混合しながら、30分間摂氏37度でインキュベートします。
インキュベーション後、DNase Iの2マイクロリットルを直接反応ミックスに加えます。ボルテックスを回転させ、チューブを下に回転させ、サーマルミキサーでさらに15分間インキュベートします。コントロールジェル用のDNA処理製品の2マイクロリットルのアリコートを予約し、マイナス80°Cで保存します。
ポリAテーリングの場合、10Xポリポリメラーゼ反応バッファーの5マイクロリットルとポリAポリメラーゼの5マイクロリットルをDNA処理反応に加えます。渦とミックスをスピンダウン。その後、サーマルミキサーで30分間インキュベートします。
反応が完了したら、コントロールジェルに2マイクロリットルのアリコートを取り、マイナス80°Cで保存します。5素分脱リン酸化試薬を原稿の指示に従ってポリA尾製品に直接加えます。ボルテックスをスピンダウンし、さらに30分間サーマルミキサーでインキュベートします。
南極ホスファターゼを不活性化するために、80°Cで2分間のインキュベーションで脱リン酸化反応に従ってください。次に、専用のRNA精製キットを使用して、インビトロ転写mRNAを精製します。マイクロボリューム分光光度計で溶出したmRNAの濃度と純度を測定します。
以前に収集したアリコートを使用して変性アガロースゲルを実行し、単一の製品、正しい転写長、およびポリAテーリングの存在を確認します。mRNA トランスフェクション バッファーの事前に計算された量から mRNA トランスフェクション試薬の量を差し引いた量と mRNA を反応チューブに加えてトランスフェクションの準備をします。mRNAストックを解凍し、チューブを反転して穏やかに混ぜます。
次に、事前に計算されたmRNAの体積を反応管に加えます。ボルテックスとmRNAトランスフェクション試薬との反応ミックスをスピンダウンし、次いでmRNAトランスフェクション試薬の適切な量を反応ミックスチューブに加える。チューブを渦し、それを回転させます。
その後、室温で15分間インキュベートします。一方、マクロファージの培養培地を新鮮な温かい培地に置き換える。トランスフェクションミックスのインキュベーションが完了したら、マクロファージを含むプレートウェルにミックスを加え、外側から井戸の真ん中まで円で入れ加えます。
トランスフェクションミックスの均一な分布を確保するために、プレートを垂直方向および水平方向にそっと揺らします。その後、プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%を少なくとも6時間インキュベートします。インキュベーション後、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、またはイムノブロットでトランスフェクション効率を分析します。
この手順の最も重要な部分は、すべてのマクロファージが同じ量のmRNAと接触するようにトランスフェクションミックスの均一な分布を確保することです。このプロトコルは、一次マクロファージのトランスフェクションのためのFLAGタグ付きNEMOおよびIKK-β変異体をコードするmRNAを生成するために正常に使用されました。mRNAの正しいサイズおよびポリAテーリングはアガロースゲル電気泳動によって検証された。
GFPをコードするmRNAを生成し、フローサイトメトリー解析を行うことでトランスフェクション効率を確認した。トランスフェクション速度はトランスフェクションmRNAの量とともに増加し、PMでは50~65%、BMDMでは80~85%に達した。PMおよびBMDMの両方において、トランスフェクトされた細胞におけるEGFPの発現レベルは、時間および用量依存的に増加した。
重要なことに、ヨウ化プロピジウム陽性またはアネキシンV陽性マクロファージの分析は、トランスフェクション手順が溶菌またはアポトーシス細胞死を誘発していないことを確認した。FLAGタグ付きニモまたはIKK-β変異体をコードするmRNAのトランスフェクション効率を免疫蛍光顕微鏡で分析した。ニモmRNAの割合は約60%、IKK-βmRNAでは55%であった。
このプロトコルは、CreリコンビナーゼをコードするmRNAを生成するためにも使用された。400ナノグラムのCreリコンビナーゼmRNAを用いた400,000 BMDMのトランスフェクションは、48時間後にニモタンパク質のほぼ完全な枯渇をもたらし、非常に効率的なトランスフェクションを示した。インターロイキン1ベータ、インターロイキン-6および腫瘍壊死因子の検出可能な量の不在は、トランスフェクション手順が炎症促進シグナルを活性化しないことを示す。
我々の比較的単純な方法により、最終的に原発マクロファージで変異タンパク質またはタグ付きタンパク質を効率的に発現させることができます。これにより、分子レベルでマクロファージ機能の解析が実質的に進んでいくだろう。
