Name: analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
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This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).

ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）1.細胞培養<ol><li>細胞培養フラスコのコーティング<ol><li>フィブロネクチン溶液を調製し、15 mL遠心管に10mLのPBSを加えます。 150μLのフィブロネクチンを加え、よく混ぜます。 </li><li>底部を覆うようにT-25細胞培養フラスコは、フィブロネクチン溶液2mLを加えます。インキュベーター中で37℃で少なくとも3時間、細胞培養フラスコをインキュベートします。フィブロネクチンコーティングしたフラスコを37℃/ 5％CO 2で2週間貯蔵することができます。 </li></ol></li><li>シーディングとHBMECの細胞培養<ol><li>細胞培養フラスコの底から吸引フィブロネクチン溶液。 6mLのECM-B培地に懸濁7.2×10 4 HBMEC / cm2での追加（= ECM-Bは、5％ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および1％の内皮細胞増殖サプリメントを補充しました）。 37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。顕微鏡を用いて毎日細胞増殖を確認してください。 </li><li> 3日ごとに培地を変更します。HBMECが約80％コンフルエンスに達し収穫または分割細胞、。 HBMECは、生理学的特性の損失を避けるために、継代1と15の間で使用されるべきです。 </li></ol></li><li>収穫HBMEC。 <ol><li> 1の比でPBSでACCUTASE（1X）を混合することにより、ACCUTASE溶液を調製する：1。さらに使用するまで水浴中で37℃でACCUTASEソリューションをしてください。 </li><li> 15mLの遠心管に細胞培養フラスコからECM-B培地を移します。洗浄HBMEC細胞培養フラスコの底に5 mLのPBSを添加することによって。吸引PBSと洗浄工程を繰り返してさらに2回。 </li><li> 2 mLのACCUTASE予め温めソリューションを追加します。 2分間37℃でインキュベートします。その後、HBMECはしっかりと細胞培養フラスコを数回タップして再懸濁されています。細胞の剥離を顕微鏡を用いて制御されます</li><li>以前に15 mLチューブに格納されたECM-B媒体はすぐHBMECデタッチし始めるようにバック細胞培養フラスコに添加します。最もHBMECがあるまで繰り返しフラスコの底をすすぎます再懸濁しました。 </li><li> 15mLの遠心管に細胞懸濁液を移します。室温で10分間、300×gで遠心分離。上清を捨て、1mLのECM-B培地中に細胞を再懸濁。細胞をカウントし、mLのECM-B培地あたり3×10 5 HBMECの最終濃度を達成するために、細胞懸濁液を希釈します。 </li></ol></li></ol>細胞培養インサートの調製<ol><li>細胞培養インサートのコーティング 重要な注意 ：細胞培養インサートの膜に触れないようにしてください。 <ol><li>各細胞培養インサートに100μLのフィブロネクチン溶液（1.1.1を参照）（ 図1A）、96ウェル平底プレートの1つのウェル（光制御ウェル）を加えます。 37℃で少なくとも3時間インキュベートします。インキュベーション吸引フィブロネクチンソリューションの後。 </li><li>細胞培養インサートとウェルの光学制御に100μLHBMEC懸濁液を加えます。 600μlのECM-B媒体は、セルの下部コンパートメントに追加します培養インサート。 3インキュベート-障壁の完全性（ 図1B）が到達するまでCO 2、37℃/ 5％で4日間、ウェルの光学制御にHBMECの微視的評価によって細胞増殖を確認。注意：4日先以降の細胞増殖を、お勧めしません。 </li><li>オプション：炎症状態を模倣するためには、下部区画から培地を吸引し、24時間遊走アッセイ前に500 U / mLのIFN-γ/ TNF-αを補充したECM-B培地と交換してください。 </li></ol></li></ol>遊出アッセイの日にエバンスブルー3.品質管理<ol><li>エバンスブルー溶液の調製<ol><li> 15mLの遠心チューブを用いて200μlのB27サプリメントとPBS / B27溶液混合物10 mLのPBSを調製しました。エバンスブルーストック溶液を希釈した（20mg / mLのPBS）1：PBS / B27 1,000。 </li></ol></li><li>エバンスブルー透過性アッセイ<ol><li>上部コンパートメントに続く下部コンパートメントから培地を吸引コンフルエントHBMEC単層を含有するもの、細胞培養インサート。細胞培養インサートに100μLエバンスブルー溶液を追加します。 </li><li>下部コンパートメントに600μLのPBS / B27を追加し、37℃/ 5％CO 2で60分間インキュベートします。慎重にピンセットを用いて、細胞培養インサートを取り外します。 </li></ol></li><li>エバンスブルーの測定<ol><li>下部コンパートメントからPBS / B27を除去し、黒色ポリスチロール96ウェル平底プレートの2つのウェルに100μLずつ移します。テカンインフィニットM200プロプレートリーダーでプレートを挿入し、最適なz位置を決定します。 </li><li> （例：励起：620nmで、発光：680nmの励起帯域幅：9nmで、発光帯域幅：20nmの、175x強調、25のフラッシュ、積分時間：20マイクロ秒）エバンスブルー用いて、各設定の尺度励起。 </li><li> HBMECバリア機能を決定するためにシードした後の異なる時点でHBMEC横切るエバンスブルー透過性を示す標準曲線に取得したデータを比較しますINGの細胞（右図1B）。 </li></ol></li></ol> 4.移動アッセイ<ol><li>末梢血単核細胞（PBMC）の調製。 <ol><li> 15 mLの遠心分離管に10 mLのRPMIを追加し、200μLB27のサプリメントを追加します。 5分間300×gでPBMCと遠心細胞を数えます。 5×10 6細胞/ mLでRPMI / B27の最終濃度にPBMCを再懸濁。 </li></ol></li><li>移動アッセイのセットアップ<ol><li>コンフルエントHBMEC単層（ 図1A）を含む細胞培養インサートの上部区画に続く下部区画から吸引媒体。ドナーあたりにつき24ウェルプレートの1つのウェル（in vitroでの対照）にも、細胞培養インサート100μLPBMC懸濁液各々を追加し。 </li><li> in vitroでの対照のPBMCに細胞培養インサート500μLの下部区画に600μLのRPMI / B27を追加し、37℃/ 5％CO 2で6時間インキュベートします。 </lI&gt; </ol></li><li>移行したPBMCの収穫<ol><li>ピンセットを用いて、細胞培養インサートを取り出し、慎重に膜を触れることなく400μLPBSでボトムをすすぎます。細胞培養インサートを廃棄します。 </li><li>ならびにインビトロ制御するために挿入してよく混合細胞培養の下部コンパートメントに20μLフローカウント蛍光粒子（約1,000ビーズ/μL）を加えます。転送サイトメトリー管を流れるようにPBMC懸濁液を得1mLの。 </li></ol></li></ol> 5.フローサイトメトリー<ol><li>サンプル調製<ol><li>室温で5分間、300×gで遠心分離PBMC。 </li><li> 100μLに蛍光標識抗体を添加することによって抗体溶液を調製するには、サンプルあたり緩衝液（PBS / 1％BSA / 2mMのEDTA）フローサイトメトリー。 1μLCD4-FITC、1μLCD3-PerCPを/ Cy5.5を以下に示す結果を得るために、1μLCD56-PC7、1μLCD8-A700、および1μLのCD16-A750は、サンプルごとに使用しました。 </li><li>再懸濁PB抗体溶液の100μLにMC、4℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 250μLを5分間300×gでバッファと遠心フローサイトメトリーを追加します。 </li></ol></li><li>サンプル取得<ol><li>フローサイトメトリー緩衝液の必要量の再懸濁PBMC（使用するフローサイトメーターに依存して変化します）。 </li><li> （ - 700 nmの励起488 nmの発光525）フローカウント蛍光粒子を検出するために525と700 nmの波長の間の活性検出器を、フローサイトメーターを用いて染色したPBMCを取得します。 （カルツァGソフトウェアで動作サイトメーターGallios流れた場合、次の手順は一例では、使用される：（1）コンピュータを起動し、オペレーティングシステムが完全にロードされたとき（2）、ボタン「オンサイトメーター」を押すことでフローサイトメーターを開始します。 （3）「オープンプロトコル」ボタンを押すことにより、それぞれの取得プロトコルをロードする。（4）必要なプロトコルを選択し、「開く」を選択する。（5）右でクリックすることにより、すべてのサンプルのためのプロトコルを複製フィールド上の仮想カルーセルと左クリックで表示プロトコルの上でマウスボタンは、「複製」。 （6）サンプル・リスト内の各サンプルにラベルを付けます。 （7）カルーセルの示された位置にサンプルを移し、取得を開始します。） </li></ol></li><li>サンプル分析<ol><li>それぞれのソフトウェアを使用してフローサイトメトリーのデータを結果として開きます。 in vitroでの対照ウェルから遊出PBMCの対象ならびに細胞の亜集団の数を決定し、それぞれの分析ソフトウェアを使用してカウント蛍光粒子を流れます。 ゲーティング戦略を結果部分に与えられている（実施例（ 図1 C：NK細胞サブセットの遊出を分析するために、第一前方散乱チャネル（FSC）プロット対側方散乱チャネル（SSC）中でリンパ球を選択リンパ球です。次いで、CD56プロット対CD3及びCD56 + CD3に表示- NK細胞が選択されるNK細胞サブセットを区別するために、NK細胞は、で表示されますCD56 CD16に対してプロット及びCD56 明るい CD16 /暗く-ならびにCD56 ディム CD16 + NK細胞が選択されます。また、流量計蛍光粒子は、SSCプロット対FSCから選択され、その後、それらの数を決定するための時間対525と700nmの間の発光を有するチャネルのプロットで表示します）。 </li><li>各試料の総細胞数を計算するために、流量計蛍光粒子を用いた細胞の検出数を正規化します。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> in vitroでの制御中の全遊走細胞と全細胞の比として遊走した細胞のパーセンテージを決定します。 </li></ol></li></ol>

The author(s) declared the following potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article: A.S.-M. and U.B. have no financial disclosures. T. S.-H. received travel and conference expenses from Biogen. N.S. received speaker and advisory board honoraria from Biogen and Novartis Pharma, as well as travel expenses from Biogen. H.W. received compensation for serving on Scientific Advisory Boards/Steering Committees for Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He also received speaker honoraria and travel support from Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis, and Sanofi-Genzyme. He received compensation as a consultant from Biogen, Merck Serono, Novartis, and Sanofi-Genzyme. H.W. received research support from Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany, and Sanofi US. C.C.G. received speaker honoraria and travel expenses for attending meetings from Genzyme, Novartis Pharma GmbH, and Bayer Health Care.

ここでは、ヒトの血液脳関門を通過するリンパ球の遊出を調査する手法を提示します。 CNSへのリンパ球遊走のin vitroでの解析では 、リンパ球の血管外漏出、潜在的な疾患関連の変更、および新しい治療アプローチの基本的なプロセスを研究することが重要です。 血液脳関門モデルのいくつかの変更が可能です。例えば、上部区画からの細胞を非遊走細胞集?...

組織への血液からリンパ球遊走は免疫監視のために重要です。特定の分子間相互作用の順序は、小腸、皮膚、リンパ節、中枢神経系（CNS）、および他の組織1内に部位特異的血管外遊出を確実にします。リンパ球遊走における変化は広い拡散疾患2の数の病態生理に関与しています。免疫特権CNSへの移行は厳密に調節され、それに応じて、このプロセスの変化は脳脊髄炎3、視神経脊髄炎、脳卒中、及び多発性硬化症（MS）2、4、5、6、7のようなCNS関連疾患に関与しています。したがって、より良い病気の病態生理を理解し、のためのツールを開発するために、リンパ球の血管外漏出を研究することが重要です<html>疾病負担8、9、10、11、12の干拓。 リンパ球は、異なる経路を介してCNSに移動します。脈絡叢内の血液-脳脊髄液関門を介して、及び血液脳関門を通過くも膜下空間に後毛細血管細静脈を通って溢出1に記載されている、13、14、15。血液脳関門を横切って移動は、内皮細胞14とリンパ球との相互作用によって行われます。周囲の内皮細胞とは対照的に、CNSの内皮細胞は、それによって厳密に血液脳関門を通過することが可能な細胞およびタンパク質の量を制限する、タイトジャンクション分子を大量に発現します小娘= &quot;外部参照&quot;&gt; 16。タイトジャンクションの緩みにおける炎症の結果および接着分子の発現を誘導します。従って、CNS 1、17、18へのリンパ球の遊走を増強します。 血液脳関門を介した血管外漏出は、多段階プロセスです。内皮細胞へのテザーを、リンパ球、次いで主セレクチン1、15により媒介されるプロセスにおける内皮に沿って転がります。その後、リンパ球上に発現内皮によって分泌ケモカインそれぞれケモカイン受容体との間の相互作用は、それによって内皮細胞1に強固な接着を促進し、インテグリンの立体構造変化を誘導します。最後に、血管周囲の空間にtransmigrating前に、血流に対する内皮バリアに沿っていずれかのクロールをリンパ球、または直ちに直接transmストール強固な接着1、19、20のサイトでigrate。リンパ球の血管外漏出のすべての手順は、異なる技術21を用いてインビトロで分析することができます。タイムラプスビデオ顕微鏡は、初期テザリングとローリング15を研究するために使用されます。接着アッセイは、障壁22を内皮細胞へしっかり逮捕に関する詳細な情報を提供します。ここで実証されるように遊出アッセイは、免疫細胞の遊出21、23、24、25、26、27、28、29の分析を可能にします。 体外血液脳関門モデルに人間を使用して、我々は最近、高いMIGRことを示すことができましたCD56 明るい CD16 dimに/のatory容量-そのCD56 ディム CD16 +対応物と比較して、NK細胞は、クモ膜下区画21において、このNK細胞サブセットの優位性により反映されました。したがって、我々の実験は、in vivoでの状況を模倣するのに適しのようです。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>without CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; or MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>from bovine plasma</td></tr><tr><td>T-25 cell culture flask</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clear, 6.5 mm diameter, 3.0 &amp;micro;m pore size</td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>stock solution: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well black flat bottom plate</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-well plate</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Flow Count Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-color flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

analysis of lymphocyte extravasation using an in vitro model of the human blood-brain barrier

中枢神経系（CNS）へのリンパ球の血管外漏出は、免疫監視のために重要です。リンパ球の血管外漏出の疾患関連変異は、CNSにおける病態生理学的変化をもたらす可能性があります。このように、CNSへのリンパ球遊走の調査は、炎症性CNS疾患を理解するために、新たな治療アプローチを開発することが重要です。ここでは、リンパ球の血管外漏出を研究するために、ヒトの血液脳関門のin vitroモデルを提示します。ヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）がコンフルエント血液脳関門の内皮を模倣するように挿入TRANSWELL多孔性ポリエチレンテレフタレート上に成長させます。バリア機能は、閉鎖帯occludens免疫組織化学、経内皮電気抵抗（TEER）の測定ならびにエバンスブルー透過の分析によって確認されます。 NK細胞-このモデルは、CD56 明るい CD16 dimに/ような稀なリンパ球サブセットの漏出の調査を可能にします。 Furtherm鉱石、他の細胞、サイトカインおよびケモカイン、疾患関連の変化、およびリンパ球の遊走能に異なる治療計画の効果を研究することができます。最後に、内皮バリアに炎症性刺激の影響だけでなく、異なる治療計画を解析することができます。

ヒト血液脳関門モデル（ 図1A）を使用して、NK細胞およびT細胞サブセットの遊出を示す代表的な結果が示されています。 HBMEC単層の完全性は、タイトジャンクション分子ZO-1、経内皮電気抵抗（TEER）の測定、及びエバンスブルー透過（ 図1B）の染色によって確認しました。 3次- 4日間培養HBMECは、タイトジャンクション分子ZO-1（左図1Bを<...

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Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

20.3K ビュー.  University Hospital Münster. Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro. 

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Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

生物工学

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

医学

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

免疫・感染学

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of non-essential ions and toxic substances. Tight junctions (TJ) effectively seal the paracellular space in the monolayers resulting in an intact barrier. This study describes a LY-based fluorescence assay that can be used to determine its apparent permeability coefficient (Papp) and in turn can be used to determine the kinetics of the formation of confluent monolayers and the resulting tight junction barrier integrity in hCMEC/D3 monolayers. We further demonstrate an additional utility of this assay to determine TJ functional integrity in transfected cells. Our data from the LY Papp assay shows that the hCMEC/D3 cells seeded in a transwell setup effectively limit LY paracellular transport 7 days-post culture. As an additional utility of the presented assay, we also demonstrate that the DNA nanoparticle transfection does not alter LY paracellular transport in hCMEC/D3 monolayers.

We present a fluorescence assay to demonstrate that Lucifer Yellow (LY) is a robust marker to determine the apparent paracellular permeability of hCMEC/D3 cell monolayers, an in vitro model of the human blood-brain barrier. We used this assay to determine the kinetics of a confluent monolayer formation in cultured hCMEC/D3 cells.

ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

免疫蛍光染色による血液脳関門モデルの解析

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

著者スポットライト:ヒト組織研究のための組織チップ技術の使用の促進 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

<meta charset="utf8"></head><body>蛍光色素を用いたマウスの血液脳関門破壊の可視化

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

使用してリンパ球血管外漏出の分析

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人間の細胞に基づく、血液脳関門の接触モデルの作製のための改善された方法

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ルシファーイエロー - ヒト血液脳関門の細胞モデルにおける堅牢な細胞透過性マーカー

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

血液脳関門のモデル化のためのMicroSiM(μSiM)バリア組織プラットフォームの使用

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軽度外傷性脳損傷のマウスモデルにおける血液脳関門破壊の評価

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